TGF-β1通过JAK2/STAT3信号对胃癌细胞侵袭和转移的影响*

王卉卉 张炜宇 李爱英 刘颖

(1.南京市江宁医院肿瘤内科,江苏 南京 211100；2.东南大学附属中大医院普外科,江苏 南京 210009)

胃癌作为一种早期症状不明确的恶性肿瘤，患者在治疗后还会有复发和转移的风险，也是造成死亡的主要因素，大多数情况下都是在50～60岁之间发生[1-2]。胃癌患者患病初期不具有明显症状，病情处于潜伏期时，患者为对身体的微小反应未重视，以至于失去诊断的最佳时期，发现时通常已经处于发展状态，开始向周围组织转移[3]。胃癌临床治疗基于外科，通过化学疗法、放射疗法、生物学疗法等综合治疗来进行辅助，但效果不理想易复发[4]。近几年研究表明，作为调节细胞增殖及分化的重要因素，胃癌的浸润及转移受到TGF-β1的表达的间接影响。TGF-β1参与了许多生理学和病理学过程，可引起细胞外矩阵和基底膜的分解，从而促进癌细胞的转移和迁徙能力[5-6]。JAK2/STAT3信号传输路径与血液肿瘤、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤的病因有关，JAK2/STAT3信号传递路径异常活跃，抑制这一通路将成为肿瘤治疗的新目标[7-8]。STAT3在恶性肿瘤中主要表现为持续的酪氨酸氧化状态，下游靶基因失调由STAT3过度活化造成，引起不被控制的细胞增殖，阻碍肿瘤细胞的凋亡[9]。癌细胞增值肿瘤微血管生成，参与肿瘤的免疫回避，并抑制免疫功能，致使癌细胞侵袭、转移致其他脏器。本研究探讨TGF-β1通过JAK2/STAT3信号对胃癌细胞侵袭和转移的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 Trizol试剂(浙江AMEKO)，逆转录试剂盒(武汉赛维尔)，RT-PCR试剂盒、流式细胞(上海优予，BCA蛋白浓度测定试剂盒、RPMI-1640培养基(上海一研)。

1.2 细胞处理及分组 准备含10%牛胎血清的RPMI-1640培养基，向培养基中加入处理后的BGC-823细胞和1%氰基链霉素，2～3 d的传代培养，在37℃,CO25%的条件下培养，细胞生长至80%～90%，离心5 min，调整细胞浓度1×104/ mL，24 h后按1∶5接种到培养瓶。弃去培养基，加入由10%FBS/F12配制成的0 μg/L(0 μg/L组)、1.0 μg/L(1.0 μg/L组)、10 μg/L(10 μg/L组)、50 μg/L(50 μg/L组)四种浓度的 TGF-β1反应12 h。

1.3 细胞形态学观察 选择不同浓度TGF-β1处理后的BGC-823细胞，做成细胞涂抹标本，二甲苯脱蜡时间15 min，用乙醇驼色，用苏木素-伊红(HE)染色，染色后乙醇脱水，每张涂片随机选择视野，置于显微镜(400×)下观察BGC-823细胞形态。

1.4 RT-PCR法检测细胞中JAK2/STAT3的表达 Trizol法提取经过处理的BGC-823细胞的总RNA，将提取出的总RNA 反转录成 cDNA，此过程遵照说明书进行，用DNA荧光染料SYBR GreenⅠ对JAK2/STAT3表达水平进行检测，内参为β-actin。在60℃环境下10 min、95℃ 和720℃环境下各 30 s、95℃环境下5 min，循环次数以40为准，实验次数至少3次，取基因相对表达量进行分析，引物序列,见表1。

表1 PCR引物序列

1.5 Westernblot检测细胞中JAK2/STAT3蛋白 裂解经过处理的BGC-823细胞，提取组织中的总蛋白质浓度，用100 V SDS-PAGE电泳总蛋白质，用Bradford法定量蛋白质样本，转印到PVDF膜上，10%山羊血清封闭0.5 h。4℃一抗过夜孵育，二抗室温孵育1 h，室温洗膜3次，GAPDH做内参，用Quantity one 4.0软件分析JAK2/STAT3蛋白表达。

1.6 流式细胞术检测BGC-823调亡情况 将TGF-β1梳理后的BGC-823细胞置入孔板中进行培养，浓度为2×106细胞/ mL，培养时间为24 h，培养完成后采用0.25%胰蛋白酶进行消化，再用70%乙醇固定，4℃环境下静置1 d，离心5 min，弃去上清液，用PBS洗涤5 min,重复三次，室温37℃，避开光照进行染色，时长30 min,用流式细胞仪分析细胞凋亡程度。

1.7 细胞克隆测定BGC-823细胞存活率 不同浓度TGF-β1处理的细胞种植到含 10 mL 培养液的培养皿中，37℃环境下培养，孵育 14 d 细胞克隆成功，用 4% 多聚甲醛固定细胞15 min，加入结晶紫染色液，染色时长 20 min，计数细胞克隆数，对各组细胞存活率进行计算。[克隆形成率(%)=(形成的细胞克隆数/接种细胞数)×100%]

2 结果

2.1 HE染色 0 μg/L组中，细胞核呈椭圆形，形状规则，且细胞排列松散，随着TGF-β1浓度增加，细胞开始逐渐增多，细胞多为圆形，多个细胞聚集，出现巨核细胞或多核细胞，50 μg/L组与其他组相比细胞数量最多(P<0.05)，见图1。

图1 HE染色结果

2.2 BGC-823细胞中JAK2与STAT3的表达情况 RT-PCR法用于检测经0、1.0 、10、50 μg/L的TGF-β1处理后细胞中JAK2与STAT3的表达水平，发现0 μg/L组JAK2、STAT3表达最低，随着TGF-β1的浓度增加JAK2、STAT3表达也增加，JAK2依次为0.618±0.114、0.637±0.177、0.919±0.351、1.268±0.278，STAT3依次为0.624±0.121、0.647±0.162、0.981±0.174、1.297±0.264(均P<0.05)，见图2。

图2 各组细胞胃癌JAK2与STAT3mRNA的表达情况

2.3 JAK2与STAT3蛋白表达 0 μg/L组JAK2与STAT3蛋白表达最低(P<0.05)，50 μg/L组JAK2与STAT3蛋白表达最高(P<0.05)，随着TGF-β1浓度增加JAK2与STAT3蛋白也明显上升，蛋白表达与浓度成正比(均P<0.05)，见图3。

图3 各组细胞胃癌JAK2与STAT3蛋白的表达情况

2.4 BGC-823细胞凋亡变化 流式细胞术检测发现经不同浓度TGF-β1处理后，0μg/L组细胞凋亡最多，50μg/L组细胞凋亡最少，随浓度增加依次减少，凋亡率分别为2.48±0.21、2.31±0.19±0.11、0.818±0.08(均P<0.05)，见图4。

图4 BGC-823细胞凋亡变化

2.5 细胞克隆测定细胞BGC-823细胞的克隆能力 细胞克隆实验检测发现在0 μg/L组BGC-823的单克隆群数最少(P<0.05)，而50 μg/L组细胞单克隆群数显著增加(P<0.05)，随着TGF-β1浓度增加BGC-823单克隆形成率有上升趋势(均P<0.05)，见图5。

图5 BGC-823细胞的克隆能力

3 讨论

胃癌是常见的临床消化系统肿瘤，近年来发病率有所下降，但发病率和死亡率依然占世界全身性恶性肿瘤的8%和10%[1]。胃癌的早期诊断能减缓病情进展，加之有效的治疗方法也是改善患者预后的重要手段，据统计，早期胃癌如果能得到针对性治疗，可将患者5年生存率提升至90%或以上[11]。但即使是发达国家，被确诊的患者50%以上都进入了疾病发展期，手术完全消除病变和转移的可能性在50%以下[12]。胃癌的病因是相当复杂的病理学过程，包括多个基因和分子信号传输路径，与胃癌有关的许多因子被发现了，但对胃癌的目标疗法起决定性的作用并不多[13]。根据病因和目标疗法的研究基础。JAK2/STAT3信号通路和TGF -β1以及一些炎症关联因子慢慢地被用于胃癌的治疗[14]。

通过观察HE染色、细胞凋亡变化、克隆能力发现0 μg/L组细胞核呈椭圆形，形状较规则，细胞排列松散，随着TGF-β1浓度增加，细胞开始逐渐增多，呈圆形型排列紧密，多个细胞聚集，有巨核细胞或多核细胞出现，50 μg/L组与其他组相比细胞数量最多。流式细胞术检测发现经不同浓度TGF-β1处理后，0 μg/L组细胞凋亡最多，50 μg/L组细胞凋亡最少，随浓度增加依次减少，细胞克隆实验检测发现在0 μg/L组BGC-823的单克隆群数最少，而50 μg/L组细胞单克隆群数显著增加，随着TGF-β1浓度增加BGC-823单克隆形成率有上升趋势。研究显示，TGF -β1是具有25 kd分子量的二本链多肽，可促进细胞增殖，调节细胞分化，并且促进细胞外矩阵合成的作用[15]。有研究表明，TGF -β1在很多的肿瘤中出现过表达，并且在肿瘤细胞的EMT进行的诱导中发挥重要的作用，TGF-β1活性得到抑制可使肿瘤体积减少[16]。有研究显示，TGF-β1及其关联TGF-β信号传输路径，在胰脏癌等其他恶性肿瘤的发张过程中也有TGF-β1参与[17]，国内外的多的研究显示，TGF-β1/ 2可作为恶性肿瘤的预后指标使用[18]。相关研究显示，TGF-β1的负调节可以对向肿瘤关联成纤维细胞的分化产生抑制作用，并且可以阻碍肿瘤增生的微小环境的形成[19]，这与本文研究相符。

通过检测JAK2/STAT3表达情况和蛋白变化发现，RT-PCR法用于检测经0、1.0、10、50 μg/L的TGF-β1处理后细胞中JAK2与STAT3的表达水平，发现0 μg/L组JAK2、STAT3表达最低，随着TGF-β1的浓度增加JAK2、STAT3表达也增加。Westernblot检测结果显示0 μg/L组JAK2与STAT3蛋白表达最低，50 μg/L组JAK2与STAT3蛋白表达最高，随着TGF-β1浓度增加JAK2与STAT3蛋白也明显上升，蛋白表达与浓度成正比。有研究证实，STAT3蛋白是一种异常活跃的转录因子[20]，通过与JAK2激酶反应增加活性使自己磷酸化，特定靶基因因受到磷酸化的STAT3影响，开始转录功能，并诱导相关蛋白，影响细胞增殖、分化和凋亡[21-22]。有研究显示，JAK2 / STAT3是VEGF基因的直接转录活性化因子，根据p53的作用机制调节HIF-1活性[23]。有研究显示，JAK2/STAT3可以促进肿瘤细胞VEGF的形成，促进血管新生血管内皮细胞游走和细胞管结构的形成。

4 结论

本研究结果显示，TGF-β1通过活化JAK2/STAT3信号传输路径，可增强胃癌细胞的浸润和转移。