miR-326靶向PHB2对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

郭嘉鸿 魏华 徐可 梁照志

(新乡市中心医院,河南 新乡 453000)

糖尿病肾病是临床常见的疾病之一，随着病情严重程度的增加导致终末期肾脏病的发生，因而急需寻找有效阻止糖尿病肾病进展的治疗方法〔1〕。肾小管上皮细胞凋亡、间质炎性细胞浸润等造成细胞外基质增多从而引起肾小管损伤、肾间质纤维化〔2〕。因而探究肾小管上皮细胞损伤机制成为糖尿病肾病的研究重点。微小RNA(miRNA)可能通过影响肾小管上皮细胞凋亡从而参与糖尿病肾病的发生〔3〕。微小RNA-326(miR-326)在1型糖尿病患者外周血单核细胞中上调表达，并可能参与糖尿病发生及发展过程〔4〕。miR-326在类风湿关节炎患者外周血单核细胞中高表达，其高表达量与类风湿性关节炎活动度相关〔5〕。通过生物信息学分析显示PHB2可能是miR-326的靶基因，研究表明PHB2在系膜细胞缺氧模型中表达降低，并可能参与细胞缺氧损伤过程〔6〕。本研究通过高糖诱导肾小管上皮细胞模拟细胞损伤模型，观察细胞中miR-326、PHB2的表达水平并分析其对细胞凋亡及炎性因子表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人肾小管上皮细胞HK-2(美国ATCC细胞库)；Lipofectamine2000(美国Thermo Fisher)；anti-miR-326、anti-miR-NC、miR-326 mimics、miR-NC、si-PHB2、si-NC(上海吉玛制药)兔抗人B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体购自美国CST公司；pcDNA3.1(上海远慕生物)；Trizol、反转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒(大连宝生物工程)；白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒(上海百蕊生物)；细胞凋亡试剂盒(美国Sigma)；二抗购自武汉艾美捷科技有限公司；兔抗人PHB2抗体(美国Abcam)。

1.2方法

1.2.1实验分组 取对数期HK-2细胞，设置对照组(葡萄糖浓度5.5 mmol/L的DMEM培养基)、高糖组(葡萄糖浓度25 mmol/L的DMEM培养基)〔7〕。取对数期HK-2细胞接种于24孔板，用Lipofectamine2000分别将anti-miR-NC、anti-miR-326、pcDNA、pcDNA-PHB2、anti-miR-326与si-NC、anti-miR-326与si-PHB2转染至70%融合HK-2细胞，置于DMEM高糖培养基中培养24 h，分别记作高糖+anti-miR-NC组、高糖+anti-miR-326组、高糖+pcDNA组、高糖+pcDNA-PHB2组、高糖+anti-miR-326+si-NC组、高糖+anti-miR-326+si-PHB2组。

1.2.2qRT-PCR检测细胞中miR-326、PHB2 mRNA的表达水平 采用Trizol法提取各组HK-2细胞的总RNA，逆转录后，扩增cDNA。qRT-PCR反应检测miR-326、PHB2 mRNA的相对表达量。

1.2.3酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-6、TNF-α含量 高糖孵育24 h后，收集细胞培养基上清液，按照试剂盒步骤检测IL-6、TNF-α水平。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡率 每组收集1×104个HK-2细胞，按照凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.2.5双荧光素酶报告基因检测miR-326的靶基因 WT-PHB2、MUT-PHB2分别与miR-NC、miR-326 mimics共转染至HK-2细胞，转染24 h后收集HK-2细胞，检测其相对荧光素酶活性。分别将miR-NC、miR-326、anti-miR-NC、anti-miR-326转染至肾小管上皮细胞，Western印迹检测各组PHB2蛋白水平。

1.2.6Western印迹检测PHB2、Bax、Bcl-2蛋白表达 收集各组HK-2细胞加入适量RIPA裂解液提取细胞总蛋白，按照电压100 V、时间90 min进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后按照电流300 mA、时间30 min进行转膜。用一抗稀释液(1∶1 000)4℃孵育10 h，再用二抗稀释液(1∶2 000)25℃孵育1 h。ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-326和PHB2在高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤中的表达 与对照组相比，高糖组HK-2细胞中miR-326表达水平显著升高(P<0.05)，PHB2 mRNA及蛋白表达量显著降低(P<0.05)，见图1、表1。

图1 两组PHB2蛋白表达

2.2抑制miR-326表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响 对照组比较，高糖组IL-6及TNF-α水平均显著升高(P<0.05)；与高糖+anti-miR-NC组比较，高糖+anti-miR-326组IL-6、TNF-α水平均显著降低(P<0.05)，见表1、表2。

2.3抑制miR-326表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响 与对照组比较，高糖组凋亡率及Bax水平均显著升高(P<0.05)，而Bcl-2水平显著降低(P<0.05)；与高糖+anti-miR-NC组比较，高糖+anti-miR-326组凋亡率及Bax水平均显著降低(P<0.05)，而Bcl-2水平显著升高(P<0.05)，见表1、表2、图2、图3。

1～4：对照组、高糖组、高糖+anti-miR-NC组、高糖+anti-miR-326组图2 Western印迹检测凋亡相关蛋白的表达

图3 抑制miR-326表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响

2.4PHB2过表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响 与高糖+pcDNA组相比，高糖+pcDNA-PHB2组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05)，IL-6和TNF-α水平、Bax蛋白水平显著降低(P<0.05)，见图4、图5、表3。

1，2：高糖+pcDNA组、高糖+pcDNA-PHB2组图4 Western印迹检测各组PHB2、Bcl-2及Bax的表达

图5 PHB2过表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响

2.5miR-326靶向调控PHB2的表达 miR-326与PHB2存在结合位点，见图6。转染miR-326可显著降低野生型载体WT-PHB2的相对荧光素酶活性(P<0.05)，见表4。miR-326组PHB2蛋白(0.22±0.03)显著低于miR-NC组(0.61±0.06，P<0.05)；anti-miR-326组PHB2蛋白(0.93±0.09)显著高于anti-miR-NC组(0.58±0.05，P<0.05)，见图7。

图6 PHB2的3′UTR中含有与miR-326互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

图7 miR-326靶向调控PHB2的表达

2.6干扰PHB2表达逆转了抑制miR-326表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的作用 与高糖+ anti-miR-326+si-NC组相比，高糖+anti-miR-326+si-PHB2组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05)，IL-6和TNF-α水平、Bax蛋白水平显著升高(P<0.05)，见图8、图9、表5。

1，2：高糖+anti-miR-326+si-NC组，高糖+anti-miR-326+si-PHB2组，下图同图8 Western印迹检测PHB2及凋亡相关蛋白的表达

图9 干扰PHB2表达逆转了抑制miR-326表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的作用

3 讨 论

miR-326在脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠中表达上调，并可促进炎症因子的表达〔8〕。研究表明miR-326在自身免疫性疾病中表达异常〔9〕。相关报道指出miR-326可通过激活核因子(NF)-κB信号通路从而促进炎症反应的发生〔10〕。本研究结果显示高糖诱导的肾小管上皮细胞中miR-326的表达上调，IL-6、TNF-α水平升高，与相关文献报道结果相似〔11〕，抑制miR-326表达可明显降低IL-6、TNF-α水平。本研究结果显示高糖处理后，肾小管上皮细胞凋亡能力增强，与相关文献报道结果相似〔12〕，而抑制miR-326表达可减弱细胞凋亡能力。

PHB2可调控细胞周期、细胞增殖及凋亡等多种细胞生物学过程，研究表明PHB2表达量降低与肾小管上皮细胞损伤有关〔13，14〕。

综上，高糖处理后肾小管上皮细胞中miR-326表达上调，PHB2表达下调，抑制miR-326表达可靶向上调PHB2表达从而抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡及炎症反应的发生。