自噬在狼疮肾炎足细胞中的作用研究进展①

郭傲扬 邢 倩 （青岛大学附属青岛市市立医院风湿免疫科，青岛266071）

自噬是依赖溶酶体途径高度保守的细胞降解过程，对维持细胞内环境稳态和细胞存活至关重要，适度自噬在细胞中发挥保护作用，过度自噬会导致细胞损伤［1］。有证据表明自噬在维持肾脏稳态和自身免疫病的发生发展中发挥重要作用［2-3］。系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者早期肾脏受累通常预后不良，尽管积极应用抗炎及免疫抑制治疗，很多狼疮肾炎（lupus nephritis，LN）患者仍发展为慢性肾脏病或终末期肾病［4］。足细胞通过抵抗肾小球内高静水压并形成分子筛来维持肾脏超滤功能，作为肾小球滤过屏障，足细胞损伤与蛋白尿密切相关，而足细胞的丢失会导致肾小球硬化［5-7］。足细胞是高度分化的细胞，其再生能力非常有限，在基础状态下，足细胞自噬水平较高，且自噬是防止足细胞损伤的关键［8］。LN 发病机制复杂，研究表明足细胞损伤在LN 的发生发展中发挥重要作用［9］。本文对自噬在LN 足细胞作用中的最新研究进展予以综述。

1 足细胞中自噬概述

自噬包括巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。其中针对巨自噬的研究最多，本文所述的自噬即巨自噬。自噬由自噬相关基因（autophagy-related‑gene，ATG）调控。在饥饿、低氧、药物等因素作用下，待降解的细胞成分包裹在双层分隔膜中，随后分隔膜逐渐延伸，最终待降解的成分被双膜囊泡包裹形成自噬体，自噬体通过微管系统运输至溶酶体融合形成自噬溶酶体［10］。自噬体在溶酶体内降解，供给细胞新的成分和能量，与此同时溶酶体通过自噬溶酶体再造重新生成。自噬溶酶体伸出管状结构释放出原溶酶体小囊泡，这些小囊泡最终获得酸性和溶酶体腔蛋白而成熟为新生溶酶体，自噬溶酶体再造可恢复游离溶酶体水平，在自噬末期维持溶酶体稳态［11］。最终受损或多余胞质内容物被降解重新利用，溶酶体回归正常，细胞度过危险回归稳态。

研究发现正常足细胞内存在自噬泡，晚期自噬抑制剂氯喹促进微管相关蛋白轻链3（LC-3）Ⅱ表达，说明足细胞内自噬的高活性；内毒素诱导足细胞损伤，自噬激活剂雷帕霉素可减轻内毒素对足细胞的损伤，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）可加重损伤［12］。特异性敲除ATG5 基因的小鼠表现为足细胞丢失和迟发性肾小球硬化，且更易罹患肾小球疾病［13］。以上研究表明细胞自噬激活对足细胞稳态至关重要。

2 LN足细胞中的自噬

2.1 LN 自噬相关基因 目前，基因组广泛关联研究（GWAS）已发现100多个与SLE发病相关的基因，其中一些自噬相关基因，如：ATG5、CDKN1B、

DRAM1、CLEC16A、ATG16L2、ATG7、IRGM、LRRK2、MAP1LC3B、MTMR3、APOL1 与SLE 易 感 性 相关［14-15］；APOL1、MTMR3 和ATG5 的单核苷酸多态性与肾脏受累有关［16-17］。不同的基因多态性可导致不同的异常自噬，这些基因多态性不仅奠定了LN 患者自噬异常的基调，还影响了LN的严重程度。

2.1.1 ATG5 一项来自意大利的涉及315 例SLE患者和265 例健康人的队列研究发现，在ATG5 的3 个等位基因（rs573775、rs6568431 和rs2245214）中，rs6568431 变异的等位基因与罹患LN 高风险相关，进一步发现rs6568431 中的ATG5 mRNA 表达更高［16-18］。在中国人群中发现ATG5 罕见变异体的频率在LN 和SLE 中增加［19］，可见罕见的ATG5 变异体在中国狼疮患者中的重要作用。

2.1.2 APOL1 APOL1 是人血清锥虫分解因子，通过靶向锥虫的溶酶体和线粒体膜，并触发膜的去极化杀灭锥虫体［20］。非洲人群中存在APOL1 的两个变异体，即G1（rs73885319）和G2（rs71785313），当人体存在这两个风险基因时，抵抗锥形虫的能力增强，但自噬受到抑制，降低细胞抵抗不利影响的能力［21］。G1/G2 风险等位基因与肾小球疾病相关，与欧洲裔美国人相比，非裔美国SLE 患者更易进展为LN，并在具有APOL1 风险基因型的SLE 患者中发现LN相关的终末肾病发生得更早［22］。

2.1.3 MTMR3 MTMR3 是磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）磷酸酶的一种，这些磷酸酶与磷脂酰激酶相互调节PI3P 细胞水平，参与自噬的起始并控制自噬体大小［23］。在中国北方汉族人群中发现MTMR3 的rs9983A 变异体与LN 风险密切相关［24］。表达分析显示，具有这种变异的血液样品和LN 患者肾脏活检样品中的MTMR3 转录水平较低。血清MTMR3表达与C3、C4 和尿蛋白水平呈负相关，敲除肌管蛋白，MTMR3 和MTMR14 与LC3-Ⅱ水平升高有关［25］。进一步的机制研究发现，在SLE 中，MTMR3 的rs1253 变异可能通过影响miR-181a 和MTMR3 间的相互作用导致自噬增加，从而加重病情［26］。

2.2 LN足细胞中影响自噬的重要调节分子

2.2.1 哺乳动物雷帕霉素蛋白靶蛋白（mTOR）mTOR 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞生长和增殖中发挥核心作用［27］。mTOR 激酶与不同蛋白质形成复合物，分别称为mTOR 复合物1（mTORC1）和mTOR 复合物2（mTORC2），mTORC1 对雷帕霉素更敏感，自噬激活剂雷帕霉素通过抑制mTOR 促进自噬［28］。当细胞中缺乏营养物质时，mTOR 表达降低，Ⅲ类磷脂酰肌醇3 激酶（classⅢPI3K）和ULK1 激活促进细胞自噬［29］。细胞和动物实验已有明确证据表明雷帕霉素可有效治疗LN。雷帕霉素治疗后的小鼠肾炎减轻，抗双链DNA 抗体滴度和肾脏中IgG的沉积降低［30］。LN 患者血清IgG 抗体和IFN-α分别通过活性氧和mTORC1 影响小鼠肾脏足细胞自噬，使用雷帕霉素后可进一步增强自噬，减轻小鼠足细胞损伤［31］。另外，一些靶向mTOR 的小编码RNA 如miR-183 也可改善LN 小鼠的疾病进展，深入发掘这类小编码RNA 在LN 诊治中的作用具有广泛前景［32］。PI3K/Akt/mTOR 异常激活是LN 的病理状态之一。LN患者肾脏组织中B细胞活化因子（BAFF）、p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 的mRNA 和蛋白水平显著增加，且LN 患者肾脏组织中BAFF mRNA 和蛋白水平与p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 水平呈正相关［33］。雷帕霉素对PI3K/Akt/mTOR 通路也可产生负调节作用［34］。雷帕霉素潜在的治疗作用不仅可以阻断mTOR，还能对LN中的致病通路产生负调节作用。

2.2.2 钙和维生素D 临床观察到狼疮患者往往由于日光照射不足、疾病活动、糖皮质激素的使用等原因发生血清Ca2+降低。研究证明，游离Ca2+减少导致自噬抑制，细胞内外Ca2+螯合剂均可抑制自噬，但抑制Ca2+依赖的蛋白激酶对自噬作用很小，而游离Ca2+减少可导致自噬抑制［35］。提示血清游离Ca2+对自噬的重要影响。维生素D不仅促进人体肠道对钙、磷的吸收，还可提高人体免疫力。YU 等［36］研究证实维生素D 可改善足细胞功能并减少狼疮IgG处理的足细胞中的自噬，但维生素D对自噬的作用尚不明确。更有说服力的研究发现，维生素D 介导的保护无法改善选择性Atg7 敲除小鼠受到的紫外线照射损伤，提示维生素D 通过增加而不是减少自噬而减轻有害因素的损伤［37］。进一步的机制研究发现，维生素D3 可通过cathelicidin 诱导人单核细胞/巨噬细胞自噬［38］。鉴于Ca2+缺乏在患者中的广泛存在和维生素D 的广泛使用，深入研究维生素D 和Ca2+对自噬的作用机制具有重大意义。

2.2.3 p53 肿瘤抑制因子p53 与自噬关系密切。DNA损伤或缺氧等因素可激活肿瘤抑制因子p53调节细胞周期、分化、凋亡、衰老和自噬［39］。DNA 受损时，p53启动修复受损DNA，同时自噬通过形成自噬体包裹细胞内产生的有害物质，自噬溶酶体降解自噬体内容物提供DNA 修复原料和大量的能量修复DNA，最终p53 表达减少［31］。而突变的p53 蛋白通过阻遏关键自噬相关蛋白和酶，如：BECN1（和PBECN1）、DRAM1、ATG12、SESN1/2 和P-AMPK，可显著抵消自噬囊泡的形成及其与溶酶体的融合，抑制自噬通量促进胰腺和乳腺癌细胞增殖，mTOR 抑制剂依维莫司可改善病情［40］。临床观察到活动期SLE 患者外周血单个核细胞中的p53 和血清p53 抗体表达显著高于健康对照，研究发现，健康人群中不存在p53 抗体，SLE 患者中存在p53 抗体，且活动期高于稳定期，LN 中p53 抗体血清阳性率较SLE 的其他表现更为突出［41］。后续有研究发现，SLE 患者产生的抗DNA 和p53 抗体可在功能上阻断p53 激活，且缺乏p53下游效应蛋白Gadd45a和p21会诱导小鼠发展为狼疮样综合征［42-43］。足细胞可摄取SLE自身抗体［44］，因此推测p53 蛋白抗体和抗DNA 抗体进入足细胞后，足细胞DNA受损，DNA修复被抑制，自噬因而被激活，激活的自噬有助于足细胞存活。

2.3 LN不同病理类型中的足细胞自噬 既往研究表明LN 足细胞存在不同的自噬状态。ZHOU 等［45］发现足细胞中自噬激活最明显，QI 等［31］发现在LN小鼠和狼疮患者肾脏活检样品中，肾脏固有细胞中只有足细胞可检测到自噬激活。狼疮患者血清中IgG 抗体和IFN-α 是导致LN 足细胞受损的关键因子，大量研究认为激活的自噬保护了LN 足细胞免受患者血清中IgG 抗体和IFN-α 诱导的损伤［31，36］。进一步的机制研究发现，LN 患者的IgG 和IFN-α 可通过产生活性氧或激活mTORC1 影响鼠和人足细胞自噬，使用3-MA 和shATG5 抑制自噬后，足细胞损伤加重，自噬激活剂雷帕霉素促进自噬改善了上述症状［31］。足细胞的自噬能力对其在LN 致病环境中的存活具有作用。

2.3.1 Ⅲ型、Ⅳ型 Ⅲ型和Ⅳ型狼疮患者肾脏足细胞中自噬体明显多于对照组和Ⅱ、Ⅴ型LN 患者，且自噬体在Ⅲ、Ⅳ型LN 患者间无显著差异，足细胞自噬体数量和LC3 蛋白表达在Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ-Ⅳ型LN 中逐渐升高且高于健康对照，Ⅴ-Ⅲ型足细胞中自噬体的数量虽然大于对照组，但差异无统计学意义［46-47］。

2.3.2 Ⅱ型、Ⅴ型 与对照组相比，Ⅱ型和Ⅴ型LN患者中观察到的自噬体更少，而Ⅲ、Ⅳ型LN 患者中检测到的自噬体数量更多［31，47］。病理形态上，足细胞融合在Ⅱ型LN 中最高且高于Ⅰ型，但在Ⅲ型中忽然降低，然后从Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅴ+Ⅲ型、Ⅴ+Ⅳ型逐渐升高［47］。与上述发现相反，另有研究发现Ⅴ型肾炎足细胞中的自噬体增加，而Ⅲ、Ⅳ类狼疮患者足细胞中检测到的自噬体数量更少［36］。Ⅴ型LN是一种继发性膜性肾病（secondary membranous nephropathy，SMN），SMN 可能从侧面显示了Ⅴ型LN 足细胞内的自噬变化。有报道发现膜性肾病内自噬减少，在原发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）中观察到mTOR 激活，自噬体少于SMN，而雷帕霉素促进自噬可保护SMN 足细胞免受补体诱导的损伤［46，48-50］。Ⅴ型LN患者足细胞中的自噬体少于IMN 的现象提示Ⅴ型LN 足细胞中可能存在的更多的抑制自噬的因素值得关注。

2.4 与LN鉴别的其他肾炎中的足细胞自噬

2.4.1 膜性肾病 JIN 等［46］研究了15 例健康人、26 例IMN 患者（Ⅰ期14 例、Ⅱ期12 例）和15 例SMN（LN）患者，结果提示IMN 患者足细胞中自噬体减少，这一现象随着病理分期从Ⅰ期到Ⅱ期呈加重趋势，且Ⅴ型LN 患者足细胞中的自噬体少于IMN 患者。膜性肾病患者根据肾小球滤过率（eGFR）分为eGFR≥60 ml/min 和eGFR＜60 ml/min 两组，eGFR 低则自噬体数量多［48］。膜性肾病的重要致病机制是补体激活，膜攻击复合物在足细胞质膜上组装，最终导致足细胞损伤和蛋白尿。膜攻击复合物可通过抑制溶酶体酸化、mTORC1 信号通路等抑制足细胞自噬［51-52］。使用3-MA 抑制自噬可加重补体攻击复合物诱导的损伤［50］。氯喹可部分模拟膜攻击复合物孵育的小鼠足细胞损伤，促进自噬可通过抑制内质网应激和异常激活的mTORC 通路改善足细胞损伤［51-53］。综上，膜性肾病足细胞中自噬被抑制，激活自噬在减轻膜性肾病足细胞损伤中发挥重要作用。

图1 p53蛋白和mTORC1对狼疮肾炎足细胞自噬的调控Fig.1 Regulation of p53 protein and mTORC1 on autophagy of podocyte in LN

2.4.2 糖尿病肾病 糖尿病肾病小鼠肾小球中足细胞和自噬体数量明显减少、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显降低，腹腔注射雷帕霉素后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高，自噬功能恢复，蛋白尿减少［54］；同时也有研究在糖尿病肾病小鼠中发现足细胞中存在自噬激活，表现为高糖刺激下的足细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高于低糖对照组，自噬蛋白ATG5 缺失可加速糖尿病引起的足底病变和肾小球硬化［55］。糖尿病肾病中存在活性氧、内质网应激等促进足细胞自噬的因素，同时高糖、过度营养使得mTOR、AMPK 过度活化等因素抑制自噬［56-59］。糖尿病肾病足细胞中存在的自噬低表达或高表达可能与细胞所处环境有关。随着疾病进展，糖尿病肾病足细胞中的自噬被抑制，足细胞抵抗高糖损伤能力下降，而激活自噬可增强足细胞抵抗高糖所致损伤的能力，进而延缓病情进展。

3 展望

LN 是SLE 最常见的并发症，自噬在LN 的发生发展及防治中具有重要意义，LN足细胞中存在自噬功能障碍，虽然自噬在LN 足细胞中是激活还是受阻仍存在争议，但已有明确实验证明调节自噬可改善足细胞损伤。临床中治疗LN 的常用药物，如羟氯喹、雷帕霉素、他可莫斯等可作用于自噬，自噬激活剂和自噬抑制剂可能在疾病的不同阶段作用于自噬的不同步骤影响疾病进展［60］。通过药物靶向调节自噬可能成为研究热点。细胞自噬的机制是一个复杂、动态的过程，对于自噬的观察需要在多个维度用多种实验方法验证，其在足细胞凋亡和信号通路中的作用也还有很多疑问。近年来细胞自噬参与LN 足细胞损伤导致的蛋白尿的具体机制研究尚处于初期，深入研究自噬在LN 发生发展中的作用将为LN的诊治提供新思路。