lnc AL928768.3 通过miR-92a-3p/ADAM10 轴对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响①

钟 环 陈海聪 刘田丰 杨树凯 魏 波 欧阳汉斌

（广东医科大学附属医院骨科中心关节外科，湛江524000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的自身免疫性疾病，以慢性炎症、滑膜细胞增生异常、关节肿胀压痛为特征，发病机制尚不清楚［1］。早期诊断、新药物及治疗方案能够有效改善RA 患者预后［2］。但部分患者对治疗无反应，随着病程发展，可能导致患者残疾［3］。因此，寻找治疗RA的新靶点势在必行。滑膜成纤维细胞（synovial fi‑broblasts，SFs）是滑膜内膜重要组成。RA 期间，SFs过度激活导致薄滑膜增生并形成血管翳样结构。RA 早期阶段包括滑膜中存在活化的SFs，伴有侵袭性表型，如过度增殖、抑制凋亡等［4］。但SFs 在RA发生发展中的作用机制尚未阐明。目前治疗策略并不针对活化的SFs。因此，了解异常激活SFs的潜在机制有助于识别新的诊断标志物和治疗靶点。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是长度超过200个核苷酸的转录物，通过调节SFs增殖和凋亡等参与RA 发生［5］。微小RNA（microRNA，miRNA）是另一类非编码RNA，在自身免疫病中表达失调［6］。lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络在多种疾病中发挥关键作用，其中lncRNA 已被证明具有miRNA海绵功能［7］。最近研究表明，lnc AL928768.3在RA 滑膜组织标本中的表达明显高于对照，且lnc AL928768.3 是RA 危险性和活动性的新生物标志物［8］。但lnc AL928768.3 在RA 患者SFs 中的作用尚不清楚。本研究通过生物信息学软件LncBase Predicted v.2和TargetScan预测发现，lnc AL928768.3与miR-92a-3p及miR-92a-3p与ADAM10 存在特异性结合位点，因此，本研究拟探讨lnc AL928768.3通过miR-92a-3p/ADAM10 轴调控RA-SFs 增殖和凋亡的机制，为RA治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织来源 28 例RA 患者滑膜组织取自广东医科大学附属医院行膝关节置换术或膝关节滑膜切除术的患者，入选患者无其他关节异常或全身性疾病。另取28 例无慢性或急性关节相关疾病膝关节创伤患者的滑膜组织作为健康对照。标本采集后立即使用生理盐水冲洗干净，液氮中保存。本研究受试者知情同意，并经广东医科大学附属医院伦理会批准。

1.1.2 试剂 RA-SFs 细胞系MH7A 购自美国ATCC；RPMI1640 培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；lnc AL928768.3 小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、ADAM10 siRNA 和siRNA control、lnc AL928768.3 过表达载体质粒和pcDNA3.1 空载体质粒、miR-92a-3p mimics 和mimics control、miR-92a-3p inhibitors 和inhibitors control 购自上海吉玛制药；Lipofectamine3000 脂质体购自美国Invitrogen 公司；MTT 试剂购自美国Amresco 公司；Trizol 试剂购自北京索莱宝；逆转录试剂盒、qPCR 检测试剂盒购自赛默飞世尔；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购 自 日 本TaKaRa；ADAM10、PCNA、Cleaved Cas‑pase-3单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国CST 公司；SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、双荧光素酶报告系统检测试剂盒购自上海碧云天。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染和分组 采用含10%胎牛血清及100 U/ml青-链霉素双抗的RPMI1640培养基培养MH7A 细胞，培养条件为：5%CO2、37 ℃、95%湿度。对数期MH7A细胞以1×105个/孔接种至6孔板，培养过夜，细胞60%汇合时转染，根据Lipofectamine3000说明书将lnc AL928768.3 siRNA、ADAM10 siRNA、lnc AL928768.3过表达载体质粒、miR-92a-3p mimics、miR-92a-3p inhibitors 及相应阴性对照转染至MH7A 细胞，6 h 后更换新的RPMI1640 培养液继续培养48 h，分别记为si-AL928768.3 组、si-NC 组、si-AL928768.3+anti-miR-92a-3p 组、si-AL928768.3+anti-miR-NC 组、si-ADAM10 组、si-ADAM10+antimiR-92a-3p 组、si-ADAM10+AL928768.3 组，未转染的MH7A细胞记为Mock组。

1.2.2 qPCR检测lnc AL928768.3和miR-92a-3p表达 采用Trizol 试剂提取滑膜组织和转染48 h 的各组MH7A 细胞总RNA，测定RNA 浓度和纯度，逆转录合成cDNA，qPCR 试剂盒进行反应，扩增结束后分 析 样 品Ct 值，2-ΔΔCt计 算lnc AL928768.3 和miR-92a-3p 表达，内参基因分别为GAPDH 和U6，引物序列为lnc AL928768.3 F：5'-CGTGACCTCTGTGGCT‑GCTA-3'，lnc AL928768.3 R：5'-TTGTGATGTTG‑GCGGTTAGTGG-3'；GAPDH F：5'-GAGTCCACTG‑GCGTCTTCAC-3'；GAPDH R：5'-ATCTTGAGGCT‑GTTGTCATACTTCT-3'；miR-92a-3p F：5'-CTCAACT‑GGTGTCGTGGAGT-3'；miR-92a-3p R：5'-GCAATTCAGTTGATACAGGCCG-3'；U6 F：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；U6 R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.3 双荧光素酶报告基因实验 根据生物信息学在线数据库LncBase Predicted v.2 和TargetScan预测结果，将与miR-92a-3p 结合位点的靶序列分别插入荧光素酶报告载体，构建lnc AL928768.3 野生型（lnc AL928768.3-Wt）和突变型（lnc AL928768.3-Mut）及ADAM10 野生型（ADAM10-Wt）和突变型（ADAM10-Mut）重组荧光素酶报告载体质粒，采用Lipofectamine3000分别将重组载体质粒分别与miR-92a-3p mimics 或mimics control 共转染至MH7A 细胞，继续培养48 h，收集各组MH7A 细胞，根据双荧光素酶报告基因试剂盒分别测定萤火虫和海肾荧光值，分别计算各组MH7A细胞相对荧光素酶活性。

1.2.4 MTT 检测细胞增殖 对数期MH7A 细胞接种至96孔板，接种密度为5×103个/孔，按1.2.3 转染，48 h后除去旧培养液，添加新的培养液，20 μl/孔添加MTT溶液继续孵育4 h，添加150 μl二甲基亚砜溶解沉淀，酶标仪测定490 nm 处光密度（OD）值，实验重复3次，以OD值评估各组MH7A细胞增殖能力。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 各组MH7A细胞转染48 h，胰蛋白酶消化细胞，收集约6×105个细胞，PBS 洗涤数次，添加适量结合缓冲液重悬细胞，添加5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI充分混匀，室温避光孵育15 min，加入适量细胞悬液，流式细胞仪检测，Cell Quest 软件分析MH7A 细胞凋亡率，实验重复3次。

1.2.6 Western blot检测ADAM10、PCNA和Cleaved Caspase-3 蛋白表达 各组MH7A 细胞转染48 h 后以RIPA 裂解液于冰上裂解，离心提取总蛋白，采用BCA 蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白含量，采用SDSPAGE 电泳分离蛋白，电转至硝酸纤维素膜，封闭2 h，将膜与ADAM10、PCNA、Cleaved Caspase-3 和内参GAPDH 一抗共同孵育，4 ℃摇床过夜，次日取出膜与二抗孵育2 h，化学发光试剂显影，凝胶成像系统采集图像，Image J 软件分析各条带灰度值，实验重复3次。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA患者滑膜组织lnc AL928768.3和miR-92a-3p表达 qPCR 检测发现，RA 患者滑膜组织中lnc AL928768.3 表达明显高于健康对照（P＜0.05），而miR-92a-3p表达明显低于健康对照（P＜0.05，表1）。

表1 两组滑膜组织中lnc AL928768.3 和miR-92a-3p 表达（±s，n=28）Tab.1 Expressions of lnc AL928768.3 and miR-92a-3p in synovial tissues of two groups（±s，n=28）

表1 两组滑膜组织中lnc AL928768.3 和miR-92a-3p 表达（±s，n=28）Tab.1 Expressions of lnc AL928768.3 and miR-92a-3p in synovial tissues of two groups（±s，n=28）

Note：Compared with healthy control group，1）P＜0.05.

Healthy control RA synovial tissue t P 1.00±0.10 3.52±0.341）37.626 0.000 1.00±0.09 0.37±0.041）33.848 0.000images/BZ_26_1285_1872_2248_1931.png

2.2 lnc AL928768.3 靶向调控miR-92a-3p 表达生物信息学LncBase Predicted v. 2 在线数据库预测结果显示，lnc AL928768.3 与miR-92a-3p 存在特异性结合位点（图1）。双荧光素酶报告基因实验结果表明，与miR-NC组相比，miR-92a-3p组AL928768.3-Wt细胞相对荧光素酶活性显著降低（P＜0.05），而AL928768.3-Mut 细胞相对荧光素酶活性无明显变化（P＞0.05，表2）。

表2 各组细胞相对荧光素酶活性比较（±s）Tab.2 Comparison of relative luciferase activity of cells in each group（s）

表2 各组细胞相对荧光素酶活性比较（±s）Tab.2 Comparison of relative luciferase activity of cells in each group（s）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

images/BZ_26_1281_2897_2240_2964.png

图1 lnc AL928768.3和miR-92a-3p的互补碱基序列Fig.1 Complementary base sequence between lnc AL928-768.3 and miR-92a-3p

2.3 抑制lnc AL928768.3 对MH7A 细胞增殖和凋亡的影响 qPCR、MTT、流式细胞术和Western blot检测结果显示，与Mock 组和si-NC 组相比，si-AL928768.3 组MH7A 细 胞lnc AL928768.3 表 达 明显下调（P＜0.05），OD 值及PCNA 表达均明显降低（P＜0.05），细胞凋亡率、miR-92a-3p 和Cleaved Cas‑pase-3 表达均明显升高（P＜0.05）；Mock 组和si-NC组以上指标差异无统计学意义（P＞0.05，图2、表3）。

表3 各组MH7A细胞OD值、凋亡率、lnc AL92±s）Tab.3 Comparison of OD value，apoptosis aspase-3 expressions of MH7A cells in each group（

表3 各组MH7A细胞OD值、凋亡率、lnc AL92±s）Tab.3 Comparison of OD value，apoptosis aspase-3 expressions of MH7A cells in each group（

Note：Compared with Mock group，1）P＜0.05；compared with si-NC group，2）P＜0.05.

Mock si-NC si-AL928768.3 FP 1.00±0.10 0.99±0.09 0.28±0.031）2）80.732 0.000 1.00±0.09 0.97±0.09 2.86±0.281）2）111.511 0.000 0.73±0.07 0.72±0.07 0.41±0.041）2）26.132 0.001 0.31±0.03 0.32±0.03 0.14±0.011）2）48.474 0.000 4.25±0.61 4.73±0.66 18.16±2.071）2）110.184 0.000 0.11±0.01 0.10±0.01 0.36±0.041）2）108.500 0.000images/BZ_27_235_2210_2240_2268.png

图2 抑制lnc AL928768.3对MH7A细胞增殖和凋亡的影响Fig.2 Effect of inhibiting lnc AL928768.3 on proliferation and apoptosis of MH7A cells

2.4 干扰miR-92a-3p 逆转了抑制lnc AL928768.3对MH7A 细胞增殖和凋亡的影响 qPCR、MTT、流式细胞术和Western blot 检测结果显示，与si-AL928768.3 组 和si-AL928768.3+anti-miR-NC 组 相比，si-AL928768.3+anti-miR-92a-3p 组MH7A 细 胞miR-92a-3p 表达明显下调（P＜0.05），OD 值及lnc AL928768.3 和PCNA 表达均明显升高（P＜0.05），细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3 表达均明显降低（P＜0.05）；si-AL928768.3组和si-AL928768.3+anti-miRNC组以上指标差异无统计学意义（P＞0.05，图3、表4）。

表4 各组MH7A细胞OD值、凋亡率、lnc AL928768.3、miR-92a-3p、PCNA和Cleaved Caspase-3表达比较（s）Tab.4 Comparison of OD value，apoptosis rate，lnc AL928768.3，miR-92a-3p，PCNA and Cleaved Caspase-3 expressions of MH7A cells in each group（±s）

表4 各组MH7A细胞OD值、凋亡率、lnc AL928768.3、miR-92a-3p、PCNA和Cleaved Caspase-3表达比较（s）Tab.4 Comparison of OD value，apoptosis rate，lnc AL928768.3，miR-92a-3p，PCNA and Cleaved Caspase-3 expressions of MH7A cells in each group（±s）

Note：Compared with si-AL928768.3 group，1）P＜0.05；compared with si-AL928768.3+anti-miR-NC group，2）P＜0.05.

si-AL928768.3 si-AL928768.3+anti-miR-NC si-AL928768.3+anti-miR-92a-3p FP 1.00±0.11 0.96±0.09 2.42±0.221）2）90.735 0.000 1.00±0.10 1.00±0.09 0.31±0.031）2）75.174 0.000 0.42±0.04 0.41±0.04 0.70±0.071）2）34.482 0.000 0.15±0.02 0.15±0.01 0.32±0.031）2）119.786 0.000 18.32±2.21 18.19±2.07 7.01±1.131）2）36.319 0.000 0.35±0.03 0.34±0.03 0.16±0.021）2）46.773 0.000images/BZ_27_235_2868_2240_2927.png

图3 干扰miR-92a-3p逆转了抑制lnc AL928768.3对MH7A细胞增殖和凋亡的影响Fig.3 Interference with miR-92a-3p reversed effect of inhibiting lnc AL928768.3 on proliferation and apoptosis of MH7A cells

2.5 miR-92a-3p 靶向结合ADAM10 生物信息学TargetScan在线数据库分析结果显示，miR-92a-3p与ADAM10 3'UTR 存在靶向结合序列（图4）。双荧光素酶报告基因实验结果证实，与miR-NC 组相比，miR-92a-3p 组ADAM10-Wt 细胞相对荧光素酶活性明显降低（P＜0.05），而ADAM10-Mut 细胞相对荧光素酶活性无明显变化（P＞0.05，表5）。

表5 各组MH7A细胞相对荧光素酶活性比较（±s）Tab.5 Comparison of relative luciferase activity of MH7A cells in each group（s）

表5 各组MH7A细胞相对荧光素酶活性比较（±s）Tab.5 Comparison of relative luciferase activity of MH7A cells in each group（s）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-92a-3p tP ADAM10-Wt 1.00±0.10 0.29±0.031）11.779 0.000 ADAM10-Mut 1.00±0.09 0.94±0.09 0.817 0.460

图4 miR-92a-3p与ADAM10 3'UTR存在互补配对序列Fig.4 Complementary pairing sequence between miR-92a-3p and ADAM10 3'UTR

2.6 lnc AL928768.3 通 过miR-92a-3p/ADAM10 轴对MH7A 细胞增殖和凋亡的影响 Western blot、MTT 和流式细胞术检测结果显示，与si-NC 组相比，si-ADAM10 组MH7A 细 胞ADAM10 表 达 明 显 下 调（P＜0.05），OD 值和PCNA 表达明显降低（P＜0.05），细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3表达均明显升高（P＜0.05）；与si-ADAM10 组相比，si-ADAM10+anti-miR-92a-3p 组 和si-ADAM10+AL928768.3 组ADAM10、PCNA表达及OD值均明显升高（P＜0.05），细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3 表达均明显降低（P＜0.05，图5、表6）。

图5 lnc AL928768.3通过miR-92a-3p/ADAM10轴对MH7A细胞增殖和凋亡的影响Fig.5 Effect of lnc AL928768.3 on proliferation and apoptosis of MH7A cells through miR-92a-3p/ADAM10 axis

表6 各组MH7A细胞OD值、凋亡率、ADAM10、PCNA和Cleaved Caspase-3表达比较（±s）Tab.6 Comparison of OD value，apoptosis rate，ADAM10，PCNA and Cleaved Caspase-3 expressions of MH7A cells in each group（±s）

表6 各组MH7A细胞OD值、凋亡率、ADAM10、PCNA和Cleaved Caspase-3表达比较（±s）Tab.6 Comparison of OD value，apoptosis rate，ADAM10，PCNA and Cleaved Caspase-3 expressions of MH7A cells in each group（±s）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05；compared with si-ADAM10 group，2）P＜0.05.

3 讨论

RA 是一种常见的慢性自身免疫性疾病，特征为关节发炎、软骨破坏和骨侵蚀［9］。最近研究显示，lncRNA 参与调节RA 患者SFs 增殖、凋亡和促炎细胞因子分泌［5，10］。本研究中，lnc AL928768.3 作为miR-92a-3p的ceRNA，导致ADAM10上调并促进RA进展。越来越多的研究表明，lncRNA 是人类病理学的重要调节因子，且lncRNA 在免疫系统中起重要作用，与自身免疫病（包括RA）发生和发展密切相关［11-12］。本研究发现，RA 滑膜组织lnc AL928768.3表达升高，与既往研究结论一致［8］。功能实验显示抑制lnc AL928768.3可能抑制MH7A细胞增殖并诱导细胞凋亡。RA 中SFs 激活是受累滑膜向健康滑膜转化的关键因素，导致关节炎扩张和远处关节破坏。RA-SFs增殖增强和凋亡不足可能使其扩散，导致骨破坏。RA-SFs增殖也会导致免疫应答，最终导致 关 节 损 伤［4，13］。 本 研 究 首 先 证 明 了lnc AL928768.3 在RA 滑膜组织中表达上调，表明其参与了RA 发病机制，与既往研究关于RA 患者滑膜组织中lnc AL928768.3 表达上调一致。 但lnc AL928768.3 在RA 患者SFs 中的作用尚未阐明。本研究表明，抑制lnc AL928768.3 表达能够在体外抑制MH7A细胞增殖，并促进其凋亡。

lncRNA 通过介导功能修饰、组蛋白修饰和染色质重塑发挥作用［16］。此外，lncRNA 通过海绵状特异性miRNA 调节mRNA 转录［14-16］。研究已证实miR-92a-3p在RA患者中呈低表达；miR-92a-3p通过抑制细胞增殖、减少促炎细胞因子产生和诱导RA-SFs凋亡发挥保护作用［17］。本研究通过生物信息学工具和荧光素酶报告分析证实lnc AL928768.3直接结合miR-92a-3p。此外，抑制lnc AL928768.3 表达能够上调MH7A 细胞miR-92a-3p 表达。因此，本研究假设lnc AL928768.3 通过直接调节miR-92a-3p 在RASFs 中发挥作用，结果显示，干扰miR-92a-3p 能够逆转抑制lnc AL928768.3对MH7A细胞增殖抑制和凋亡的诱导作用，证实lnc AL928768.3是RA-SFs的癌基因，靶向调控miR-92a-3p。作为miR-92a-3p 的直接靶点，ADAM10 在RA 中高表达已被XIE 等［18］证实。本研究证实，抑制ADAM10 表达能够有效抑制MH7A细胞增殖，并促进细胞凋亡，且抑制miR-92a-3p或过表达lnc AL928768.3 能够恢复抑制ADAM10对MH7A 细胞增殖抑制和凋亡的诱导作用。由于lnc AL928768.3 可与miR-92a-3p 结合，本实验通过Western blot 检测ADAM10 表达，并证明lnc AL928768.3 能够通过海绵吸附miR-92a-3p 进而上调ADAM10 表达。证实lnc AL928768.3 通过miR-92a-3p/ADAM10 轴促进RA MH7A 细胞增殖，抑制细胞凋亡，从而促进RA发生和进展。

综上，本研究结果显示，lnc AL928768.3通过与miR-92a-3p 结合负调控miR-92a-3p 表达，从而上调ADAM10 表达。lnc AL928768.3 能够促进RA-SFs增殖，抑制细胞凋亡。因此，lnc AL928768.3可能是RA 患者有效的诊断和治疗靶点。但本研究存在一定局限性，仅涉及体外细胞实验，未在动物体内进行验证尚显不足，因此，后续将在动物体内探究lnc AL928768.3的作用和机制。