重楼皂苷I对胶质瘤细胞增殖和迁移的影响

王媛媛 邱鹏程 杜洋 郑淑娴 薛玉叶 孙光强 陆云阳 汤海峰

脑胶质瘤起源于神经胶质细胞，是最常见的颅内肿瘤之一，其特征在于快速生长和高侵袭性[1]，年发病率约为(3～6.4)/10万[2]。世界卫生组织分类系统根据恶性程度将其分为I～IV级，属于恶性级别较高的为III～IV级[3-4]。由于胶质瘤浸润性生长及高复发率的临床特征，在采用手术切除后放疗联合替莫唑胺化疗等多种治疗手段下仍预后不佳，因此迫切需要寻找新的抗胶质瘤药物[5-7]。

重楼皂苷I(polyphyllin I，PPI)(C44H70O16，又称重楼皂苷D)是中药重楼的主要成分之一，也是中国药典(2020版)规定的重楼含量检测成分之一。重楼皂苷药理作用有抗菌、抗炎、止血、抗肿瘤等，其中抗肿瘤作用得到了较深入的研究[8]，表明它们对膀胱癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺腺癌等多种肿瘤细胞的生长有显著抑制作用[9-11]。已有研究证实重楼皂苷I(D)对胶质瘤具有显著抑制作用，如：重楼皂苷D通过Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路诱导U87人脑胶质瘤细胞凋亡[12]；重楼皂苷I通过JNK途径诱导胶质瘤细胞U251凋亡以及阻滞细胞周期[13]；通过分子对接模拟PPI与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的结合方式及作用模式，从而验证PPI直接靶向STAT3抑制U251细胞增殖并诱导凋亡[14]；重楼皂苷D诱导Nb-69细胞凋亡，以及IMR-32和LA-N-2细胞坏死[15]。高级别胶质瘤具有高度侵袭性，其高度侵袭性表型限制了治疗的效果[16-17]。抑制迁移对肿瘤的侵袭具有重要作用，但PPI对胶质瘤细胞的迁移作用尚未见报道。因此，本文在验证PPI对胶质瘤U373和U251细胞凋亡的基础上，进行PPI抑制胶质瘤细胞迁移的研究。

1 材料与方法

1.1 细胞来源

胶质瘤U251细胞(目录号：TCHu 58)购自中国科学院上海细胞库，U373购自美国ATCC细胞库，并经过STR鉴定。

1.2 仪器

超净工作台(Thermo Fisher)，CO2恒温培养箱(ESCO公司)，IX83倒置显微镜(Olympus)，血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司)，Multiskan FC 酶标仪(赛默飞公司)，流式细胞仪(BD FACSCalibur)，电泳系统(Bio-Rad)，凝胶成像系统(Bio-Rad)，超纯水系统(Heal公司，NW10LVF)，超速冷冻离心机(湖南湘仪公司)。

1.3 试药

重楼皂苷I(宝鸡翊瑞生物科技有限公司，纯度≥98%，批号：AF20052303)，细胞活力检测试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)(Elabscience，货号：E-CK-A362)，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(BD，货号：556547)，全蛋白提取试剂盒(凯基生物，货号：KGP250)，DMEM培养基(Gibco，货号：11965092)，胎牛血清(Biological Industries，货号：04-121-1A)，胰蛋白酶(Solarbio，货号：T1300)，青链霉素混合液(Solarbio，货号：P1400)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(Elabscience，货号：E-BC-K318-M)，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天，货号：P0012A)；Transwell小室(NEST，批号：040922ES010410A)；切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved Caspase-3)抗体(Wanleibio，批号：M12231992)、细胞色素C(Cytochrome-C，Cyt-C)抗体(Proteintech，货号：10993-1-AP)、上皮钙黏素(E-cadherin，E-cad)抗体(Servicebio，货号：GB11868)、白细胞抑制因子2(drosophila mothers against decapentaplegic 2，Smad2)抗体(Servicebio，货号：GB11511)；β-肌动蛋白(β-actin)抗体(Proteintech，货号：20536-1-AP)；转化生长因子-β受体1(Transforming Growth Factor Beta Receptor 1 ，TGF-β R1)抗体(Servicebio公司，货号：GB11271)；其他试剂均为分析纯。

1.4 细胞培养

将U373和U251细胞培养于含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM高糖培养基中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中，取处于对数生长期且状态良好的细胞用于后续实验。

1.5 CCK-8检测细胞活力

取生长状态良好且处于对数生长期的胶质瘤U373和U251细胞，铺于96孔板，1×104个/孔，每孔加入100 μL完全培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中，待细胞生长密度约为 80%时使用，PPI以浓度梯度(0.25、0.5、1、2、4、8、16和32 μM)处理24小时，每个剂量设置3个复孔。24小时后每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育培养2小时。用酶标仪在450 nm波长下测量各孔的光密度(oplical density，OD)值，计算细胞抑制率和药物的半抑制浓度(50% inhibitory concentration，IC50)，每组实验重复三次。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期的U373和U251细胞，接种到6孔板中，2.5×105个/孔。待细胞完全贴壁后，以不同剂量PPI(0、3、6 μM)处理24小时。收集细胞，按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明进行细胞凋亡双染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率，每组实验重复三次。

1.7 细胞划痕创口愈合实验

取对数生长期的U373和U251细胞，接种到12孔板中，1×105个/孔。待细胞生长融合至80%时，用10 μL移液器的枪头在每个孔的中心垂直划线，用PBS洗涤2次，洗掉划痕处漂浮细胞，用不同剂量的PPI(0、1.5、3 μM)处理细胞，用倒置显微镜在不同时间点拍照(0、24小时)，观察划痕处愈合程度，每组实验随机拍照观察三次。

1.8 Transwell迁移实验

取对数生长期的U373和U251细胞，用无血清培养基重悬细胞，以每孔5×104个(200 μL)细胞悬液接种到Transwell上室中，下室加入700 μL有血清DMEM培养基，同时分别用不同剂量的PPI(0、3和6 μM)进行处理，在细胞培养箱中培养24小时后，取出小室，PBS轻轻清洗2次，用棉签轻轻擦去上室面细胞，将小室下表面放在95%乙醇中固定30分钟，用0.1%结晶紫染色20分钟，随机视野倒置显微镜下观察拍照，每组实验重复三次。

1.9 Western blot检测相关蛋白

将处于对数生长期的U373和U251细胞中加入不同剂量的PPI(0、3和 6 μM )处理24小时， PBS缓冲液清洗，胰酶消化后离心，预冷PBS清洗两次，加入100 μL Lysis Buffer 裂解液(按照1 mL冷Lysis Buffer加入10 μL磷酸酶抑制剂、1 μL蛋白酶抑制剂和5 μL 100 mM PMSF比例配制裂解液)，轻轻吹打混匀后置于冰上裂解30分钟，4℃、12000 rpm离心15分钟，收集上清液。各取20 μL上清液进行蛋白定量，按蛋白定量后的其余蛋白样品的四分之一体积计算所需5× Loading Buffer缓冲液，并加入原始蛋白样品中混匀。置于99℃加热10分钟使蛋白变性，即为制好的蛋白样品，可放置于-80℃保存。电泳时制备5%浓缩胶，8%分离胶，每孔上样量为5 μL，80 V跑至分离胶4/5处停止，PVDF膜标记并用甲醇活化后贴于胶面再于200 mA转膜100分钟，5%脱脂奶粉封闭1～2小时，PBST清洗，一抗4℃孵育过夜。根据一抗种属选择相应的二抗，摇床室温孵育1小时后，用PBST清洗条带6次，加入显色液使用凝胶成像系统进行发光显色，实验重复3次。

1.10 统计分析

2 结果

2.1 PPI抑制胶质瘤U373和U251细胞增殖

给予梯度浓度PPI处理24 小时后，CCK-8实验表明PPI对胶质瘤U373、U251细胞的增殖具有抑制作用，并显现出剂量依赖性。经GraphPad Prism 8.0计算IC50，得出PPI对U373和U251的 IC50值分别为3.473 μM和2.52 μM(见图1、表1和表2)。

图1 PPI剂量依赖性抑制胶质瘤U373和U251细胞增殖

表1 CCK-8法分析PPI对胶质瘤U373细胞抑制率的影响

表2 CCK-8法分析PPI对胶质瘤U251细胞抑制率的影响

2.2 PPI诱导胶质瘤U373和U251细胞凋亡

流式细胞术结果显示，加药24小时后与对照组相比，随着PPI给药浓度的增大胶质瘤U373和U251细胞凋亡率增加，具有明显的浓度依赖性(见图2、表3和表4)。

表3 流式细胞术检测PPI对胶质瘤细胞U373凋亡率的影响

表4 流式细胞术检测PPI对胶质瘤细胞U251凋亡率的影响

注： B1坏死细胞；B2晚期凋亡细胞；B3未发生调亡的细胞；B4早期调亡。细胞凋亡率：B2与B4百分率之和。

2.3 PPI抑制胶质瘤U373和U251细胞迁移

细胞划痕实验表明，PPI不同剂量(0、1.5、3 μM)给药U373和U251细胞后，划痕愈合程度小于空白对照组(见图3、表5和表6)；Transwell小室实验表明，随着PPI给药浓度的增加，迁移的细胞数量减少，说明PPI剂量依赖性抑制胶质瘤细胞迁移(见图4、表7和表8)。

表5 PPI对胶质瘤细胞U373划痕愈合率的影响

表6 PPI对胶质瘤细胞U251划痕愈合率的影响

表7 PPI对胶质瘤细胞U373迁移个数的影响

图3 PPI给药1.5 μM和3 μM剂量24小时抑制U373和U251细胞划痕创口愈合(×100)

图4 PPI给药3 μM和6 μM剂量抑制U373和U251细胞迁移(×100)

表8 PPI对胶质瘤细胞U251迁移个数的影响

2.4 PPI对胶质瘤U373和U251细胞凋亡、迁移相关蛋白表达的影响

Western blot结果表明，PPI上调凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Cytochrome c的表达(见图5和表9)，下调迁移相关蛋白TGF-β R1和Smad2的表达、上调E-cadherin的表达(见图6和表10)。

图5 PPI上调U373和U251细胞凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Cytochrome c的表达

3 讨论

神经胶质瘤是最常见的颅内肿瘤之一，具有四高一低的特点，即高发病率、高复发率、高死亡率、高致残率和低治愈率。目前临床上神经外科手术是胶质瘤的最佳和最直接的治疗方法，但因其浸润性生长且边缘不清，导致手术难以全部切除，易留下瘤根，导致复发可能性，所以术后化疗是不可缺少的治疗手段[18]。当前一线化疗药物为替莫唑胺，但治疗效果和患者生存质量尚不理想[19]。因此，寻找和开发更有效的药物来治疗胶质瘤迫在眉睫。

图6 PPI下调迁移相关蛋白TGF-β R1和Smad2、

以往对重楼皂苷I的研究主要为诱导胶质瘤细胞凋亡，尚未涉及影响胶质瘤浸润性生长的相关研究。Yu Q等[12]发现重楼皂苷D可通过调节JNK的表达来介导凋亡；LIU J等[13]通过验证得出PPI能够抑制U251细胞的生长，并诱导人胶质瘤U251细胞的G2/M期阻滞和凋亡。郑彬[20]的研究表明PPI可以诱导胶质瘤U251细胞凋亡，作用机制除可能与细胞线粒体凋亡途径的信号转导过程有关。以上研究表明PPI诱导胶质瘤细胞凋亡涉及多通路、多机制。

表9 PPI对胶质瘤细胞U373和U251中凋亡相关蛋白的影响

表10 PPI对胶质瘤细胞U373和U251中迁移相关蛋白的影响

有研究表明，皂苷类成分可诱导肿瘤细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生增加，导致线粒体膜电位崩溃，伴随细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)从胞浆的释放，从而激活半胱天冬酶(caspase)途径，诱导线粒体途径凋亡[21-22]。Cyt C从线粒体释放到细胞质基质是细胞凋亡的一组主要驱动因素，Cleaved Caspase-3为天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶，能够破坏细胞功能，在细胞凋亡的早期阶段发挥着关键性的作用[23]。Cyt C从线粒体转移到细胞质基质，还可激活切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(Cleaved Caspase-9)，并进一步导致Cleaved Caspase-3的激活[24]。以往对PPI诱导胶质瘤细胞凋亡机制研究的报道中未涉及Cleaved Caspase-3的作用。本实验采用流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示随着PPI给药浓度的增大细胞凋亡率亦增加；Western blot结果表明PPI上调凋亡相关蛋白Cyt C和Cleaved Caspase-3的表达，表明PPI通过上述线粒体途径诱导了胶质瘤U373和U251细胞凋亡。

胶质瘤出现侵袭性增强以及肿瘤容易复发，与上皮—间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的发生是密切相关的，最显著的特征包括细胞丧失极性和粘附性，并增加侵袭和迁移能力[25]。上皮钙黏素E-cadherin、TGF-β R1和Smad2均对EMT具有重要作用。E-cadherin属于跨膜糖蛋白家族，负责钙依赖性细胞间粘附。EMT的一个标志性事件是E-cadherin表达的减弱或缺失，从而介导恶性肿瘤细胞迁移和侵袭[26]。TGF-β/Smad信号通路参与细胞生长、分化和细胞稳态等生理过程，在EMT的经典信号通路中，TGF-β R1可激活Smad2进而促进细胞迁移[27-29]。TGF-β R1信号的下调被认为可以防止肿瘤细胞中的EMT[30-32]。本实验通过划痕创口愈合实验与Transwell小室实验首次证明PPI可降低胶质瘤细胞迁移的能力，Western blot表明分子机制涉及下调迁移相关蛋白TGF-β R1和Smad2，上调E-cadherin的表达。

本文在验证了PPI能够抑制胶质瘤U373和U251细胞增殖、促进其凋亡的基础上，首次发现PPI可抑制胶质瘤细胞迁移，从而使得对PPI抗胶质瘤作用机制有了更深入的理解，也为PPI抗胶质瘤作用今后的新药开发及临床应用提供了新的实验依据。