基于网络药理学研究参附注射液治疗脓毒症的作用机制

应天昊, 余涛, 赵佳宁, 孙萌萌, 祝璇, 李晓丽, 唐一迪, 张雷明

(烟台大学药学院 分子药理和药物评价教育部重点实验室，山东 烟台 264005)

脓毒症是由潜在或已知感染因素引起的全身炎症反应综合征，其发病机制复杂，涉及炎症反应失衡、神经内分泌网络异常、免疫功能障碍和多器官衰竭等多个方面[1]。世界卫生组织将脓毒症确认为全球卫生优先事项，病死率高达30%以上[2-3]。在2019年底爆发的新型冠状病毒感染中，后期危重患者多并发脓毒症，进而危及生命[4]。研究表明，中医药治疗脓毒症具有独特优势，能增加疗效、降低不良反应、改善预后等[5]。

虽然传统中医理论体系中无“脓毒症”病名记载，但根据其临床表现和演变过程，可从《伤寒论》《温热论》中发现相似症状的记载，故将其归于“热病” “温毒” “厥证” “脱证”等范畴[6]。参附注射液来源于参附方，主要成分为人参和附子，具有回阳救逆和益气固脱的功效[7]，主治厥脱及阳虚诸证[8]，同时也得到了诊疗方案《中国脓毒症/脓毒性休克急诊治疗指南》[9]的推荐，被广泛用于脓毒症的治疗[10-12]。然而，尚不清楚参附注射液是通过哪种作用机制改善脓毒症，且目前并没有具体作用机制研究。因此本文通过网络药理学和分子对接方法，以参附注射液中的活性成分为研究对象，通过靶点、通路筛选以及体内实验验证，探索参附注射液治疗脓毒症的分子机制。

1 材料与方法

1.1 参附注射液活性成分和靶点获取

通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)获取参附注射液中人参和附子2种中药的所有成分，按ADME参数[13]即类药性(drug- likeness,DL)≥0.18、口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%来筛选化合物，共得到34个活性成分。下载Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中活性成分的SDF结构文件，在Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)中检索靶点，按Probability>0筛选后即得到活性成分作用靶点。通过Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库转换得到靶点的Gene Symbol。

1.2 潜在靶点获取

在Genecards(https://www.genecards.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)和OMIM(https://www.omim.org/)数据库中检索关键词“sepsis”，整合后得到脓毒症相关靶点并与参附注射液活性成分靶点取交集，获得参附注射液治疗脓毒症的潜在靶点。

1.3 构建蛋白质-蛋白质相互作用网络

在STRING(https://string-db.org/)平台中上传1.2项中获得的参附注射液治疗脓毒症的潜在靶点，物种选项为“智人”，下载结果文件导入Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用( protein-protein interaction，PPI)网络，通过内置分析功能分析参数。

1.4 GO分析与KEGG通路分析

提交潜在靶点到Metascape(http://metascape.org/gp/)数据库，Input as species和Analysis as species都设置为homo sapiens，进行基因本体( gene ontology， GO)分析和基于京都基因与基因组百科全书 ( Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路分析(P<0.05)，探究参附注射液治疗脓毒症的可能作用机制。

1.5 构建参附注射液活性成分-脓毒症靶点-作用通路网络

创建成分-靶点-通路的Network和Type文件，导入Cytoscape软件中，构建网络图并分析。

1.6 分子对接

通过Open Babel 2.3.2软件将所选化合物的SDF结构文件转化为PDB文件，从 Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb)数据库中检索获得受体蛋白PDBID，采用AutoDockTools软件对受体蛋白进行修饰，用Grid程序下的Grid Option工具对受体蛋白进行处理，并转化为pdbqt格式。利用AutoDock Vina 1.1.2对受体蛋白与配体小分子进行分子对接，得到结合能打分，这种亲和能是衡量配体是否能与受体分子有效结合的重要指标，能值越低，二者的结合效果越好。

1.7 体内实验验证

1.7.1 动物

BALB/c小鼠(8～10周)，雄性，质量18～20 g，购自济南朋悦动物繁育有限公司，合格证号SCXK(鲁)20190003。造模前在烟台大学SPF级动物房正常饲养，室温在(22±1)℃，相对湿度为40%～60%，自由饮水摄食。

1.7.2 药物

参附注射液为华润三九(雅安)药业有限公司药品，10 mL/支，国药准字Z51020664。

1.7.3 试剂与仪器

脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)(美国Sigma公司，货号：L2630-25MG)；小鼠TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：SEKM-0034、SEKM-0007)。ERK1/2、p-ERK1/2抗体(上海碧云天生物技术有限公司，货号：AF1051、AF1891)；GAPDH抗体(美国Proteintech公司，货号：60004-1-lg)。

高速低温离心机(德国Eppendorf公司，型号：5424R)；电泳系统(美国Bio-Rad 公司，型号：PowerPacTMHC)；超纯水仪 Milli-Q (美国Millipore 公司，型号：IQ7000)；多功能酶标仪(美国MD公司，型号：SpectraMax iD3); ECL凝胶成像仪(美国GE公司，型号：ImageQuant 300/400/RT ECL)。

1.7.4 分组与模型制备

BALB/c小鼠24只，随机分成3组：空白组、模型组、参附注射液组(20 mL/kg)，每组8只。除空白组外，其他各组于给药30 min后尾静脉注射LPS(10 mg/kg)，造成小鼠脓毒症模型。

1.7.5 给药方法

参附注射液组(20 mL/kg)腹腔注射给药预保护30 min，空白组和模型组给予相同体积生理盐水。

1.7.6 检测指标与方法

1.7.6.1 炎症因子检测

造模后12 h后，在小鼠眼内呲取血，室温静置0.5 h，4 °C，3500 r/min离心15 min，离心半径5 cm，分离血清，采用ELISA法测定血清中TNF-α和IL-6含量。

1.7.6.2 Western blot法验证靶点表达

1.7.7 统计学方法

2 结果

2.1 参附注射液活性成分和靶点获取

通过TCMSP和SwissTargetPrediction数据库收集到参附注射液中的活性成分共34个，其中人参19个，附子15个，共得到682个活性成分靶点。

2.2 潜在靶点获取

通过GeneCards、OMIM和Drugbank数据库得到脓毒症靶点1422个。两者取交集后获得参附注射液治疗脓毒症的潜在靶点137个，见图1。

图1 参附注射液与脓毒症靶点维恩图Fig.1 Venn diagram of the targets of Shenfu Injection and sepsis

2.3 PPI网络构建与分析

潜在靶点的PPI网络图中共有节点137个、边1956条，见图2。结果表明，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1，92)、白介素6(IL6，91)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3，85)、肿瘤坏死因子(TNF，84)、血管内皮生长因子A(VEGFA，84)度值(degree)较大，可能是关键靶点。

图2 潜在靶点PPI网络Fig.2 PPI network of the potential targets

2.4 GO分析和KEGG通路分析

将参附注射液治疗脓毒症的潜在靶点通过GO富集分析，根据P<0.05选择生物过程、细胞组分和分子功能富集高的前10个进行可视化并生成柱状图(图3)。如图3所示，生物过程主要涉及趋性、细胞迁移正调控和细胞运动正调控；细胞组分主要涉及膜筏、膜微区和膜区等；分子功能主要涉及蛋白质酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性和以羟基为受体的磷酸转移酶活性等。

图3 参附注射液治疗脓毒症靶点的GO富集分析(排名前10)Fig.3 GO enrichment analysis of Shenfu Injection in sepsis treatment (top 10)

通过Metascape数据库对参附注射液治疗脓毒症的潜在靶点进行 KEGG 通路富集分析(P<0.05)，选取前20条通路，见图4。如图所示，这些潜在靶点主要富集在癌症信号通路、前列腺癌、乙型肝炎、PI3K-Akt信号通路、癌症中的蛋白聚糖、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、人类巨细胞病毒感染、MAPK信号通路、内分泌抵抗等信号通路。

图4 参附注射液治疗脓毒症的KEGG通路分析(排名前20)Fig.4 KEGG enrichment analysis of Shenfu Injection in sepsis treatment (Top 20)

2.5 构建参附注射液活性成分-脓毒症靶点-作用通路网络

由于潜在靶点较多，所以筛选 PPI网络图中度值排名前30的靶点参与成分-靶点-通路网络构建。如图5所示，度值较大的成分有人参皂苷-Rh4_qt、戈米辛 B、山奈酚、石防风素、水黄皮次素、去氧穿心莲内酯、人参皂苷rh2、苯甲酰欧乌头碱、吉九里香碱等，均与多个靶点连接。度值较大的靶点包括PIK3CA、AKT1、MAPK1、EGFR、MAPK3、MAPK8、PIK3R1、MAPK14、VEGFA等。度值较大的通路涉及了癌症通路、PI3K-Akt、MAPK、糖尿病并发症中的AGE-RAGE、Ras、Rap1和HIF-1等信号通路。

图5 成分-靶点-通路网络图Fig.5 Network of ingredients-targets-pathways

2.6 分子对接

将PPI网络中度值排名前10位的靶点蛋白，分别与成分-靶点-通路网络中排名前5的活性成分进行分子对接。由于脓毒症的疾病特点，所以选取了IL-6、MAPK3、TNF、VEGFA、STAT3与影响炎症和细胞凋亡有关的靶蛋白，进行分子对接，结果见图6。结合能越小，表明其结合性越好，其中MAPK3靶点与5种活性成分结合能力较好。结果表明，参附注射液中的活性成分能较好地与脓毒症相关靶点结合，潜在生物活性高。

图6 活性成分与PPI网络排名前5靶点的结合能热图Fig.6 Heat map of the compounds in Shenfu Injection radix with top five targets′ sequencing in a protein-protein interaction network

2.7 体内实验验证

2.7.1 参附注射液对脓毒症小鼠炎症因子表达的影响

与对照组相比，模型组中 TNF-α和IL-6表达显著升高(P<0.001)。与模型组相比，参附注射液(20 mL/kg)可显著降低 TNF-α和IL-6表达(P<0.05、P<0.001)，见图7。

注:与对照组相比，***P<0.001；与模型组相比，△P<0.05，△△△P<0.001。图7 参附注射液对脓毒症小鼠血清中TNF-α和IL-6表达水平的影响Fig.7 Effects of Shenfu Injection on the expression levels of TNF-α and IL-6 in the serum of septic mice n=3)

2.7.2 参附注射液对脓毒症小鼠肝组织ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达的影响

MAPK3是MAPK信号转导途径的重要组成部分，调控着ERK蛋白的表达，并且在构建的成分-靶点-通路网络中度值较大且与活性成分结合能力较好。所以，本实验通过检测参附注射液对脓毒症小鼠中非磷酸化ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达的影响，对预测靶点进行验证(图8)。结果显示，与模型组相比，参附注射液治疗能显著提高非磷酸化ERK1/2蛋白的表达(P<0.01)，降低p-ERK1/2蛋白的表达(P<0.01)。

注:与对照组相比*P<0.05，***P<0.001;与模型组相比△△P<0.01。图8 参附注射液对脓毒症小鼠肝组织中ERK1/2及 p-ERK1/2蛋白表达的影响Fig.8 Effects of Shenfu Injection on the LPS-induced protein expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2 in the liver tissue of septic

3 讨论

脓毒症是临床常见的一种危重症疾病，死亡率较高。虽然抗炎药物和免疫增强剂例如糖皮质激素和胸腺肽α1等在临床中应用广泛，但其不良反应日渐突出[14]。近年来，随着临床研究的不断开展，中医药治疗脓毒症得到广泛认可。其中参附注射液因其回阳救逆、扶正固脱的效果在脓毒症的治疗中被广泛应用[15]。但是，中药因其复杂性使研究其作用机制存在一定的困难，所以本文通过网络药理学对参附注射液抗脓毒症的作用机制进行了预测分析，为后续治疗和研究提供了新的思路。

本研究由多个数据库检索，得到34个活性成分和682个药物靶点，交集后得到137个抗脓毒症的潜在靶点，构建PPI网络并分析参数筛选排名前30的关键靶点，包括IL6、MAPK3、TNF、VEGFA、STAT3等。IL-6和TNF-α都是主要的炎性细胞因子，影响脓毒症炎症反应进展，与脓毒症的病死率有一定的相关性[16]。人参皂苷Rh4可以显着降低LPS诱导的肺损伤小鼠支气管肺泡灌洗液中的IL-6和TNF-α的表达[17]。山奈酚可以通过抑制IL-6及TNF-α对D-Ga IN糖/LPS诱导的小鼠AHF发挥保护作用[18]。石防风素通过抑制TNF-α在 CCl4诱导的大鼠肝毒性实验中具有潜在的保肝作用[19]。MAPK3通过MAPK通路来调控细胞生长和分化，还可以影响TNF-α、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)等炎症因子的表达等[20]。山奈酚可以显著减弱对乙酰氨基酚诱导的血清TNF-α和IL-6产生，下调JNK 和 ERK磷酸化从而治疗急性肝损伤[21]。VEGFA在血管内皮的完整性中起着不可或缺的作用[22]，被证明可诱导血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和ICAM-1的表达，并由于在脓毒症过程中的表达增加而导致血管内皮损伤和毛细血管渗漏[23]。在患有脓毒症的成人中，过表达的VEGFA通过与酪氨酸蛋白激酶受体1(tyrosine-protein kinase receptor-1，FLT-1)结合，改变血管内皮细胞骨架的构型而增加了血管通透性。因此，血管内皮易受损，最终导致器官功能障碍[24]。山奈酚增强了人脐静脉内皮细胞中VEGF诱导的细胞运动，以及斑马鱼胚胎中肠下血管的发芽和大鼠主动脉环中微血管的形成，从而保护血管内皮[25]。STAT3是脓毒症所致功能障碍的关键调控基因之一[26]。研究发现，STAT3在脓毒症中异常表达，不仅可以直接调控促炎和抑炎因子的表达，还可作用于炎症信号传导通路的其他关键分子来间接调控脓毒症的发生发展[27]。山奈酚通过靶向STAT3和NF-κB减轻角叉菜胶诱导的小鼠爪水肿模型[28]。

GO分析表明参附注射液中活性成分可能通过膜筏、膜微区、膜区、胞膜窖、质膜蛋白复合物等细胞组分参与细胞趋化、细胞迁移的正调控、细胞运动的正调控、细胞成分迁移的正调控等生物学过程，发挥蛋白质酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、以羟基为受体的磷酸转移酶活性、生长因子结合、磷酸酶结合等分子功能。说明参附注射液可能作用于多细胞组分产生不同的生物学功能，进而发挥抗脓毒症的作用。

KEGG富集分析表明参附注射液抗脓毒症的潜在靶点主要参与 PI3K-Akt[29]、MAPK[30]、Ras[31]、Rap1[32]和HIF-1[33]等信号通路，这些通路与脓毒症的发生发展息息相关，说明富集分析的通路具有较高的可信度。

通过体内实验，证明了参附注射液可以有效抑制脓毒症小鼠中TNF-α和IL-6的释放。同时，Western blot结果说明参附注射液可以提高非磷酸化ERK蛋白的表达，降低p-ERK蛋白的表达，从而部分调控MAPK通路，发挥抗脓毒症作用。

综上所述，本研究通过网络药理学分析参附注射液抗脓毒症的活性成分、潜在靶点和作用机制，发现了参附注射液通过多种方式发挥作用。之后通过分子对接验证了关键成分与相关靶点之间的结合活性，最后通过体内实验验证了参附注射液的药效和调控机制，为参附注射液治疗脓毒症的进一步研究奠定了基础。