顶空固相微萃取结合气质联用方法快速测定地椒挥发性成分

李启东，赵金，孔娜，黄璐瑶，潘少斌*

(1.山东中医药大学 药学院 山东省高校中药质量控制与全产业链建设协同创新中心，山东 济南 250355； 2. 山东蓝城分析测试有限公司，山东 济南250102)

展毛地椒Thymusquinquecostatusvar. przewalskii(Kom.) Ronn. 是百里香属的重要植物之一,广泛分布于山东境内山地丘陵地区[1]。作为药食两用的天然植物，具有较高的开发潜力与市场价值。展毛地椒(又名兴凯百里香)或百里香ThymusmongolicusRonn.的干燥地上部分， 为中药地椒[2-3],收载于1977年版《中国药典》[4]和《中国植物志》[5]，在中医古籍中常被作为主药使用。中药地椒别名地花椒、山椒、山胡椒，《本草纲目》即记载：“地椒出北地，即蔓椒之小者。贴地生叶，形小，味微辛”[6]，其性温，有小毒，具有祛风解表、行气止痛、温中健脾等功效，可用于治疗胃痛、关节肿痛、腹痛、气管炎、感冒、肌肤瘙痒等疾病[7]。此外，地椒作为历史悠久的天然香料，还是日化用品和食用香精的重要原料[8]。1977年版《中国药典》[4]中对地椒质量标准仅包括“来源、性状、显微鉴别、炮制、性味与归经、功能与主治、用法与用量、贮藏”项目，2020年常小强[6]参照2015年版《中国药典》相关方法，制订了地椒(兴凯百里香)质量标准草案。然而，目前针对地椒化学成分的研究仍相对较少。

百里香属植物气味芳香，现代研究表明，该属含有挥发油、黄酮类、联苯类、萜类甾体类、有机酸类等成分，挥发油是该属中的重要成分之一，是发挥药理作用的主要物质基础。由于产地不同，其挥发性成分的含量和组成差异较大[9]。目前对地椒挥发油的研究主要采用水蒸气蒸馏提取，再结合气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometry , GC-MS)进行分析[10]。但水蒸气蒸馏法仅适用于难溶或不溶于水的成分提取，且存在提取率及提取纯度较低等问题。顶空固相微萃取技术(headspace-solid phase microextraction，HS-SPME)是一种新型的样品预处理方法[11]，具有简单、快速、灵敏度高、选择性好的优点，且萃取过程中无需加入有机溶剂，可更加准确地分析待研究样本中的挥发性成分[12]。本实验选用山东省临沂市莒南县所产展毛地椒，首次利用HS-SPME快速提取地椒地上部分挥发性成分，结合GC-MS分析，共鉴定出56种化学成分，为地椒药材的质量控制和进一步开发利用提供了参考依据。

1 仪器与材料

1.1 药材

地椒采自山东省临沂市莒南县，经山东中医药大学李佳教授鉴定为唇形科植物展毛地椒Thymusquinquecostatusvar. przewalskii (Kom.) Ronn.的地上全草，阴干后待用。

1.2 仪器与耗材

GC1310-TSQ8000 EVO气相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪(美国Thermo Fisher公司)；手动固相微萃取装置(美国Supelco公司)，固相微萃取纤维萃取头类型为：50/30 μm聚二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/ CAR/ PDMS)；20 mL具聚四氟乙烯胶垫瓶盖顶空样品瓶(美国Agilent公司)；HH-6数显恒温水浴锅(常州市金坛友联仪器研究所)；JY2002型电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；高纯氦气(纯度≥99.999%，济南尧天仪器有限公司)；NIST 2014数据库(美国国家标准与技术研究院)。

1.3 方法

1.3.1 顶空固相微萃取

将固相微萃取的50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维萃取头置于气相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪的进样口中，于260 ℃下老化10 min。称取3.0 g粉碎后的地椒样品，置于20 mL顶空样品瓶中，密封。于70 ℃恒温水浴中顶空萃取60 min，随后从样品瓶中拔出萃取头，拭去纤维萃取头金属保护套管上残留水分，立即插入气相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪进样口，于260 ℃解吸3 min，进样分析。

1.3.2 仪器条件

1.3.2.1 气相色谱条件

进样方式：手动进样；进样口温度260 ℃；进样模式：不分流进样；隔垫吹扫：5 mL/min；色谱柱：DB-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：初始温度40 ℃，保持3 min，以10 ℃/min 升温至90 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min 升温至120 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升温至130 ℃，保持1 min，以5 ℃/min 升温至165 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升温至200 ℃，以10 ℃/min 升温至220 ℃，再以20 ℃/min 升温至280 ℃，保持5 min，总运行时间为57 min；载气：高纯氦气(≥99.999%)，流速：1.0 mL/min。

1.3.2.2 质谱分析条件

离子源类型：EI 源；电子能量：70 eV；接口温度：280 ℃；离子源温度：280 ℃；发射电流：50 μA；扫描方式：全扫描；质量扫描范围：29～400 aum；溶剂延迟：0 min。

2 结果

取地椒的地上部分经HS-SPME提取后，进行GC-MS分析，将所得质谱图与NIST 2014质谱数据库检索的标准图谱比对，进行定性分析，同时在完全相同的条件下，将正构烷烃样品进行色谱分析，测定各正构烷烃的保留时间，再根据公式(1)线性升温保留指数计算公式算出各组分的Kovats保留指数。

RITP=100n+100[tR(x)-tR(n)]/[tR(n+1)-tR(n)]，

(1)

式中，RITP为Kovats保留指数；tR为被测组分的保留时间，下标x为被测组分符号，下标n和(n+1)为分别具有n和(n+1)个碳原子的正构烷烃符号。

根据气相色谱-质谱总离子流图(图1)，图中数值指RT(保留时间)，采用峰面积归一化法进行定量分析，测定其相对含量，共分离鉴定出56个化合物(见OSID)，主要结果见表1。

图1 地椒地上部分顶空固相微萃取-气相色谱-质谱的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of the aerial part of Mongolian thyme herb obtained using HS-SPME-GC-MS

气相色谱-质谱总离子流图显示，经过HS-SPME提取、GC-MS分析，所得成分主要以酚醇类、萜类、烯类、酯类、醛酮类为主，其中相对含量较多的是芳樟醇(27.8%)、龙脑(9.12%)、樟脑萜(8.12%)、柠檬烯(7.81%)、3-蒈烯(5.36%)。

峰号保留时间/min保留指数RI化合物名称英文名称分子式分子量面积归一化含量/%18.099653-蒈烯3-careneC10H16136.235.3628.39979樟脑萜campheneC10H16136.238.1238.971005β-蒎烯β-pineneC10H16136.232.5449.261017左旋-β-蒎烯(1S)-(-)-β-PineneC10H16136.232.82710.221058柠檬烯cineneC10H16136.237.81810.631075罗勒烯ocimeneC10H16136.233.34910.91087γ-松油烯γ-terpineneC10H16136.231.691112.081134芳樟醇linaloolC10H18O154.2527.81514.011210龙脑borneolC10H18O154.259.121614.171215松油烯-4-醇terpinene-4-olC10H18O154.252.762516.041284乙酸芳樟酯linalyl acetateC12H20O2196.291.913220.431420β-波旁烯β-cyclobutaC15H24204.351.863421.621456β-石竹烯β-caryophylleneC15H24204.353.524123.61519大根香叶烯 Dgermacrene DC15H24204.353.354224.021533二环大根香叶烯dicyclic macrogeranieneC15H24204.351.564324.31543金合欢烯farneseneC15H24204.352.61

3 讨论

常见的挥发油提取方法有水蒸馏法、溶剂提取法、吸收法、压榨法，最常用的是水蒸气蒸馏法。水蒸气蒸馏法提取挥发油成分效率低，且在高温情况下有些挥发油会发生分解[13]。本实验首次将HS-SPME运用到地椒挥发油成分的定性和定量分析中，HS-SPME具有采样、萃取、富集、脱附、进样的功能，装置操作简单且可精确分析地椒中的挥发性成分[14]，节约时间、准确性高、安全性强[15]，已广泛应用于食品、医药、生化等领域[16-17]。

地椒中含有多种不同的化学成分，如挥发油、黄酮类、甾体类、有机酸类和萜类等[7,18]，但目前研究最为广泛的为地椒挥发油。本实验通过GC-MS结合保留指数方法，鉴定出地椒挥发油中56种挥发性成分。所得成分主要以酚醇类、萜类、烯类、酯类、醛酮类为主，其中相对含量较多的分别是芳樟醇(27.8%)、龙脑(9.12%)、樟脑萜(8.12%)、柠檬烯(7.81%)和3-蒈烯(5.36%)等。现代药理研究表明，地椒挥发油具有抗菌、抗肿瘤、抗血栓、抗氧化等活性[19]。

芳樟醇目前除广泛应用于洗化用品、食用香精外，还具有明显的镇静镇痛、抗焦虑、催眠、抗菌消炎、抗肿瘤的药理活性。Huo等[20]研究发现，芳樟醇无论在体内外，均能有效抑制脂多糖(LPS)诱导的促炎症因子TNF-α和白介素-6(IL-6)的表达，起到抗炎作用，并发现阻断核因子 NFκB 和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路可能是其发挥抗炎作用的机制。此外，张婷等[21]研究发现芳樟醇通过上调 p53、p21、p27、p57 等DNA 损伤相关基因的表达，能明显抑制多种人淋巴细胞白血病细胞增殖，而对正常骨髓造血细胞及外周血细胞的增殖没有显著影响，因此推断其具有一定的抗肿瘤作用。桉树脑类成分作为单萜类化合物，是植物精油的重要组成部分。现代研究表明，单萜类化合物特别是1,8-桉树脑及其衍生物具有抑菌活性和杀菌能力。通过对1,8-桉树脑合成衍生物进行体外抑菌实验发现，其对白色念珠菌和金黄葡萄球菌具有明显的抑制效果[22-23]。而单萜类和倍半萜类例如桉树脑和莰酮等对家蝇和蟑螂具有强的驱避活性，这与民间用药经验基本相符[24]。

地椒作为多种复方药物制剂的重要组成部分，具有较好的市场前景和开发价值。地椒挥发油具有含量高、品质优、无残留、耐抗药性等特点，而且在医药、精细化工及日常生活中应用广泛，长久以来被视为天然植物精油中的极品[25]。随着人们对天然香料需求量的增加，地椒常用作肉类除膻剂，广泛用于食品生产，其含有的邻伞花烃、香荆芥酚及石竹烯等均可用于调配香料香精，具有广阔的使用前景[26]。本实验为地椒挥发油的提取提供了新的思路，也为地椒的综合开发利用提供了科学依据。