LINC00617靶向miR-218对肺癌吉西他滨耐药性的影响

张敬毅 蒲 兵 刘秀平 周肖龙 （淄博市第一医院，淄博 255200）

越来越多的研究表明，长链非编码RNA（lnc-RNA）可以竞争性地抑制miRNAs的表达水平，并且lncRNA/miRNAs轴可以通过各种经典的信号通路或相关蛋白促进肺癌的肿瘤发生、转移和多药耐药性［1］。lncRNAs在肺癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤中对多靶点和多途径的调节失调导致化疗耐药的发生［2］。LINC00617在乳腺癌样本中表达上调，其通过激活Sox2的转录来促进乳腺癌的进展和转移，敲低LINC00617可抑制癌细胞的肺转移［3］。本研究通过Targetscan预测发现，miR-218与LINC00617存在结合位点。miR-218被报道在肺癌组织中低表达，miR-218过表达减弱了肺癌细胞的体外增殖、侵袭、集落形成和肿瘤球体形成，并抑制了体内肿瘤生长［4］。但 LINC00617 在肺癌中表达、作用及其与miR-218在肺癌吉西他滨耐药细胞中的关系目前还尚未可知。主要研究LINC00617和miR-218对肺癌耐药细胞A549-Gem增殖、凋亡和吉西他滨耐药性的影响，以期为肺癌的吉西他滨耐药性研究提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌细胞株A549购自ATCC；引物、si-LINC00617和阴性对照 si-NC、miR-NC、miR-218 mimics（miR-218）均购自上海吉玛制药有限公司；盐酸吉西他滨、胰蛋白酶、RNA提取试剂Trizol购自美国Sigma-Aldrich公司；Real-time PCR试剂盒、反转录试剂盒（RT-PCR）购自宝生物工程（大连）有限公司；Ki67、Caspase3和GAPDH抗体购自美国Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和A549-Gem耐药细胞系的建立将A549细胞培养于37 ℃下含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素的RPMI1640培养基，5%CO2培养箱中孵育。根据文献［5］采用逐步增加培养基中吉西他滨浓度，间歇诱导的方式使A549细胞产生耐药性。首先，将A549细胞培养在含10 nmol//L 吉西他滨的RPMI1640培养基中，24 h后换脱药的新鲜培养液培养2周，待细胞恢复对数生长期时再用较高浓度吉西他滨培养液筛选诱导，重复上述过程，连续培养40周，直至A549细胞可稳定生长于含终浓度1 µmol/L吉西他滨的培养液中，获得肺癌吉西他滨耐药A549-Gem细胞。

1.2.2 CCK8实验检测细胞存活率 将吉西他滨处理或/和转染后的A549、A549-Gem细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，每孔150 µl细胞，过夜培养后在培养液中加入终浓度为2、4、6、8 µmol/L的吉西他滨（约50 µl），以不加药物只加培养液作为对照，培养72 h，每孔加入 20 µl CCK8溶液，培养2 h，酶标仪测定吸光度（A）值，波长为450 nm。存活率（%）=实验组A值/对照组A值×100%。并根据存活率计算半数抑制浓度（IC50）。

1.2.3 RT-PCR检测LINC00617和miR-218的表达 用Trizol试剂提取A549和A549-Gem细胞总RNA，反转录PCR试剂盒用于制备cDNA，取cDNA和RT-PCR试剂盒检测LINC00617和miR-218的含量。引物如下：miR-218正向引物：5'-TAATGGTCGAACGCCTAACGTC-3'，反向引物：5'-CGAGTGCATTTGTGCTTGATCTA-3'；LINC00617正向引物：5'-ATTGGGAGGGGACTTAATGG-3'，反向引物：5'-GTGTTACGGAGCCAGGAGC-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH正向引物5'-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3'，反向引物 5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。运用 2-ΔΔCt法进行数据分析。

1.2.4 细胞转染 将对数生长期A549-Gem细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，细胞融合一层时进行转染。根据Lipofectamine2000转染试剂盒说明书将si-NC、si-LINC00617、miR-NC、miR-218、si-LINC00617+miR-NC、si-LINC00617+miR-218等各组载体或片段转染至A549细胞，分别记为si-NC组、si-LINC00617组、miR-NC组、miR-218组、si-LINC00617+miR-NC组、si-LINC00617+miR-218组。转染48 h，收集细胞，采用1.2.3方法验证转染效果。

1.2.5 克隆形成实验检测细胞增殖能力 将转染48 h后的各组A549-Gem细胞培养至对数生长期，收集细胞，洗涤并稀释，以1×103个/孔接种入6孔板，加入6 µmol/L吉西他滨及10%FBS的RPMI1640培养基，培养14 d，弃培养液洗涤细胞3次，固定细胞并进行结晶紫染色，拍照并计数克隆形成数。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡率 将转染后的各组A549-Gem细胞，用含6 µmol/L吉西他滨无血清RPMI1640培养基，培养72 h，收集细胞，洗涤并稀释为1×106个/ml，根据凋亡试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.2.7 Western blot实验 提取转染后的各组A549-Gem细胞蛋白，进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，加入一抗（Ki67 1∶1 000、Caspase3抗体 1∶1 000和 GAPDH 抗体 1∶4 000），置于 4 ℃过夜孵育。PBST缓冲液洗膜3次，然后加入稀释的二抗，室温孵育1 h，显影，拍照。以GAPDH为内参，分析蛋白水平。

1.2.8 双荧光素酶报告系统实验 根据1.2.4方法，在A549-Gem细胞中，将miR-218或miR-NC分别与构建的LINC00617野生型（WT）和突变型（MUT）报告载体共转染，收集转染48 h后的细胞，在Promega双荧光素酶报告系统中检测上清中荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.3 统计学处理 数据以±s表示，在SPSS19.0统计软件中进行整理分析，数据中两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差进行分析，组间多重比较采用SNK-q法。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌A549细胞和吉西他滨耐药细胞A549-Gem对吉西他滨耐药性的检测 采用2、4、6、8 µmol/L的吉西他滨分别处理肺癌细胞A549和肺癌吉西他滨耐药细胞A549-Gem，结果发现，随着吉西他滨浓度的增加，A549细胞存活率逐渐降低，但A549-Gem的存活率无显著改变，最高浓度8 µmol/L吉西他滨时 A549-Gem的存活率（97.01±7.26）%显著高于A549（43.21±5.35）%，见图1。说明A549-Gem细胞对吉西他滨具有显著的耐药性。后续实验选择对A549作用明显，对A549-Gem生存无影响且作用效果较为明显的浓度6 µmol/L。

图1 A549和A549-Gem细胞对吉西他滨耐药性检测Fig.1 Drug resistance of A549 and A549-Gem cells to gemcitabine

2.2 LINC00617在A549和A549-Gem细胞中的表达 qRT-PCR检测A549和A549-Gem细胞，结果发现，LINC00617 在A549-Gem中含量（3.19±0.14）显著高于A549细胞（1.00±0.08）（P＜0.05），见图2。

图2 LINC00617在肺癌A549和吉西他滨耐药细胞A549-Gem中的表达Fig.2 Expression of LINC00617 in lung cancer A549 and gemcitabine resistant A549-Gem cells

2.3 抑制LINC00617对A549-Gem细胞增殖、凋亡的影响 与si-NC组相比，si-LINC00617组A549-Gem细胞中LINC00617含量降低，细胞存活率和克隆形成数均降低，凋亡率升高，增殖蛋白Ki67含量降低，凋亡蛋白Caspase3含量升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图3。说明抑制LINC00617联合6 µmol/L吉西他滨处理可抑制A549-Gem细胞增殖，促进细胞凋亡，增强吉西他滨对细胞的抑制。

图3 抑制LINC00617对A549-Gem细胞增殖、凋亡的影响Fig.3 Effects of inhibition of LINC00617 on proliferation and apoptosis of A549-Gem cells

2.4 LINC00617 靶 向 miR-218 TargetScan 对LINC00617靶向miR-218的预测结果见图4。miR-218组共转染WT-LINC00617的萤火虫荧光素酶相对活性（0.20±0.02）是miR-NC组萤火虫荧光素酶相对活性（0.99±0.08）的0.20倍（P＜0.05），而miR-218组突变型MUT-LINC00617的荧光素酶相对活性（0.95±0.08）与miR-NC组（0.97±0.08）相比差异无统计学意义；抑制LINC00617可上调miR-218含量（P＜0.05），见图4。

图4 LINC00617的序列中含有与miR-218互补的核苷酸序列和双荧光素酶报告实验Fig.4 Sequence of LINC00617 contains nucleotide sequences complementary to miR-218 and dual-luciferase reporter assay system

2.5 miR-218对A549-Gem增殖、凋亡的影响 结果表明，与miR-NC组相比，miR-218组A549-Gem细胞中miR-218含量升高，A549-Gem细胞存活率和克隆形成数均降低，凋亡率升高，增殖蛋白Ki67含量降低，凋亡蛋白Caspase3含量升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图5。说明过表达miR-218联合6 µmol/L吉西他滨可抑制A549-Gem细胞增殖，促进细胞凋亡，增强吉西他滨对细胞的抑制。

图5 miR-218对A549-Gem增殖、凋亡的影响Fig.5 Effect of miR-218 on proliferation and apoptosis of A549-Gem

2.6 miR-218可以增强抑制LINC00617对A549-Gem细胞增殖、凋亡的影响 与si-LINC00617+miRNC组相比，si-LINC00617+miR-218组A549-Gem细胞中miR-218含量增高，细胞存活率和克隆形成数均降低，细胞凋亡率升高，Ki67含量降低，凋亡蛋白Caspase3含量升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图6。说明过表达miR-218增强了抑制LINC00617对A549-Gem细胞增殖、凋亡和吉西他滨耐药性的作用。

图6 miR-218可以增强抑制LINC00617对A549-Gem增殖、凋亡的影响Fig.6 miR-218 can enhanced and effect of LINC00617 inhibition on proliferation and apoptosis of A549-Gem

3 讨论

肺癌确诊时多为晚期，后期的临床耐药性是晚期肺癌患者治疗的最大障碍，因此，提高肺癌细胞的化疗敏感性具有重要意义［6］。lncRNA在耐药和药物敏感的肺癌细胞中出现差异表达，可能因为调控失调导致耐药的发生［7］。

最近研究报道，LINC00617可能参与调节癌症干细胞（cancer stem cell，CSC）的不对称分裂，并促进自我更新、耐药性和EMT，从而影响不同癌症的转移和复发［8］。LINC00617在乳腺癌样本中表达上调，其可促进乳腺癌细胞的运动和侵袭，诱导EMT并伴随着干细胞特性的产生［3］。LINC00617在治疗性神经内分泌前列腺癌（therapeutic neuroendocrine prostate cancer，tNEPC）中表达上调，与NEPC的发展有关，可能是NEPC的临床生物标志物和治疗靶点［9］。但其在肺癌中的表达情况和作用尚不清楚。本研究通过建立肺癌吉西他滨耐药细胞系A549-Gem，检测不同浓度（2、4、6、8 µmol/L）的吉西他滨下肺癌A549和A549-Gem细胞的存活率，结果发现，吉西他滨对A549-Gem的抑制率显著低于A549细胞，且LINC00617在A549-Gem细胞中表达显著上调，与上述结论类似，在A549-Gem细胞中转染si-LINC00617联合6 µmol/L吉西他滨处理可降低A549-Gem细胞的存活率和克隆形成数，促进细胞凋亡，上调Caspase3含量，下调增殖蛋白Ki67含量，说明抑制LINC00617可降低A549-Gem细胞对吉西他滨的耐药性，其可能是肺癌潜在的化疗增敏靶点［3，9］。

本研究通过TargetScan预测发现，miR-218与LINC00617存在结合位点。miR-218在多种癌症中发挥肿瘤抑制因子的作用，在宫颈癌、胃癌、肝细胞癌和骨肉瘤中表达下调，上调其表达可靶向不同的基因抑制癌细胞的迁移、侵袭、凋亡和 EMT［10-13］。miR-218多态性可作为转移性结直肠癌伊立替康化疗反应的标志物［14］。miR-218在肺癌组织中表达水平较癌旁组织明显下调，其表达水平与组织学分级和淋巴结转移密切相关，miR-218过表达可抑制细胞迁移、侵袭及EMT过程［15］。miR-218在肺癌细胞中的表达与卡铂的耐药及Mcl-1、Survivin对细胞凋亡的调控有关［16］。上述研究均表明miR-218与肿瘤进展及耐药性有关。本研究通过双荧光素酶报告和qRT-PCR实验证实，LINC00617靶向负调控miR-218的表达；过表达miR-218联合吉西他滨可抑制A549-Gem细胞增殖并促进细胞凋亡，进一步实验还发现，过表达miR-218可增强抑制LINC00617对A549-Gem细胞增殖、凋亡和吉西他滨耐药性的作用，间接验证了在肺癌中两者之间存在靶向调控关系。

本研究阐述了与肺癌A549细胞相比，在肺癌DTX耐药细胞A549-Gem中，LINC00617表达上调，LINC00617靶向miR-218调控A549-Gem细胞增殖、凋亡和吉西他滨耐药性。LINC00617可能是肺癌吉西他滨化疗增敏靶点。