牦牛源富硒鼠李糖乳杆菌的优化培养

孙建春，吴征王，邹雨婷，石 斌，吴庆侠，董海龙，田发益

（1.西藏自治区农畜产品质量安全检验检测中心，拉萨 850013；2.渠县动物疾病预防控制中心，四川 达州 635200；3.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，拉萨 850004；4.西藏农牧学院，西藏 林芝 860000）

硒（Selenium，Se）是生命必需的一种微量元素，是硒代半胱氨酸和含硒酶如过氧化物酶的必需组分，在抗癌、抗氧化等方面发挥重要作用［1］。硒是许多酶活性中心的必需组分，具有抗氧化、保护心血管和心肌健康、抗肿瘤活性、调节免疫等作用［2，3］。1973年世界卫生组织（WHO）确认，硒是人体必需的微量元素，缺硒会导致心脑血管病、高血压综合征、肝病、糖尿病、胃肠道病、哮喘、癌症等40余种并发症［4］。世界卫生组织公布的资料表明，全球有40多个国家属于低硒或缺硒地区。中国是国际公认的“缺硒大国”之一，有72%的县（市）低硒或缺硒，其中30%为严重缺硒地区，7亿多人口存在不同程度的硒摄入不足［5］。补硒的来源主要有无机硒和有机硒，而无机硒的毒性比有机硒的毒性大，同时有机硒的安全性更高，不易发生硒中毒，也易被机体吸收，所以特别受青睐［6］。本研究通过对鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）富硒条件的探索，寻找出最适宜鼠李糖乳杆菌富硒的条件，为生产牦牛源富硒乳酸菌的产品提供条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鼠李糖乳杆菌（西藏农牧学院临床兽医实验室保存），乳酸杆菌选择性肉汤（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号：20180615），其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

UV6600型紫外可见分光光度计（上海奥谱勒仪器有限公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；移液枪及枪头（凝科办公用品专营店）；BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；LRH-150型生化培养箱（江苏盛蓝仪器制造有限公司）；HDL-4型台式离心机（常州市鸿科仪器厂）。

1.3 方法

1.3.1 富硒鼠李糖乳杆菌的培养 将鼠李糖乳杆菌从-80℃的冰箱中取出，复苏，传至第3代。采用正交设计软件（正交设计助手Ⅱv3.1）设计试验方案（表1）。将亚硒酸钠配制为高浓度溶液以便后续加入到乳酸杆菌选择性肉汤中，加入亚硒酸钠最终浓度为6、8、10、12μg/mL［7］。使用复苏后的乳酸杆菌在超净工作台中按照1%（w/v）接种量接种至乳酸杆菌选择性肉汤中，按照不同的培养温度（36、37、38、39℃）、不同的加入亚硒酸钠时间（4、6、8、10 h），再加入不同浓度的亚硒酸钠溶液，恒温培养24 h，每组重复3次取平均值。

表1 鼠李糖乳杆菌富硒正交试验设计

1.3.2 标准曲线的绘制 准确吸取6μg/mL的亚硒酸钠标准溶液0、1、2、3、4、5 mL，分别加入到100 mL的烧杯中，加去离子水至35 mL，再加入5 g/100 mL EDTA-2 Na溶液1 mL，摇匀，并用1∶1的盐酸调节pH至2～3，各加入0.5%DAB溶液4 mL，摇匀，置于暗处30～50 min，再用5%NaOH调节pH至6～7，置于分液漏斗中，加入6 mL甲苯振摇2 min，静置分层，弃去水层，收集甲苯层于比色皿中，于420 nm波长处测吸光度，绘制标准曲线［8］。

1.3.3 鼠李糖乳杆菌中富硒量的测定 将鼠李糖乳杆菌培养液5 000 r/min离心10 min，弃上清液，使用去离子水清洗3次，将附着于菌体表面的硒洗去，最终放置在65℃的烘箱中烘至恒重，烘干后的重量减去加入菌体之前的重量即为菌体的重量［9］。将烘干称重后的乳酸杆菌转移至带刻度的试管中，加入硝酸-高氯酸溶液（体积比为5∶1）0.6 mL，放置过夜。然后将试管置于100℃水浴锅中加热4 h。当试管内黄褐色气体排尽后，取出冷却，加入30%过氧化氢溶液2 mL，继续置于沸水浴中消化，至消化液呈无色或淡黄色即达终点。取出试管冷却后，用去离子水定容至10 mL，同时做空白对照［10］。以空白对照调零，测定方法同标准曲线的绘制。

1）富硒率的计算。

2）富硒量的计算。

1.3.4 数据处理 采用Excel 2007软件进行数据统计处理。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的测定

使用配制的亚硒酸钠标准溶液，在420 nm波长处测量其吸光度，以亚硒酸钠中硒含量为横坐标、以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。如图1所示，硒含量在0.457～2.283μg/mL时，吸光度与硒含量成良好的线性关系，回归方程为y=0.124 6x-0.011 9（R2=0.998 6）。

图1 标准曲线

2.2 鼠李糖乳杆菌富硒量分析

从表2可知，硒转化率最高的组为1-3组，其硒转化率为85.04%，鼠李糖乳杆菌菌体富硒量高达5 648.004μg/g，但2-3组的硒转化率为74.72%，菌体富硒量高达5 901.243μg/g。当培养温度为36℃时，硒转化率都比较低，最大硒转化率只有36.80%。当温度为37℃时，硒转化率明显比36℃培养时高很多，最低为47.81%、最高为62.95%，并且随着亚硒酸钠浓度的升高，其硒转化率呈下降趋势，说明亚硒酸钠对鼠李糖乳杆菌的生长有抑制作用。当培养温度为38℃时，其硒转化率普遍较高，最高为85.04%，最低为50.34%，并且也是随着亚硒酸钠浓度的升高，硒转化率呈下降趋势。当培养温度为38℃时，10μg/mL亚硒酸钠菌液比12μg/mL亚硒酸钠菌液更有利于转化亚硒酸钠，其原因是加入亚硒酸钠的时间不同，12μg/mL的亚硒酸钠加入时间为第6 h，但10μg/mL的亚硒酸钠加入时间为第4 h。这种现象从侧面反映出高浓度亚硒酸钠对鼠李糖乳杆菌转化硒有抑制作用，加入亚硒酸钠的时间最好为鼠李糖乳杆菌生长的对数期。当培养温度为39℃时，其硒转化率也较低，最高为40.22%、最低为36.73%，但鼠李糖乳杆菌的量并没有减少；培养温度为39℃时，鼠李糖乳杆菌生长不会受到抑制，但会抑制其转化亚硒酸钠。当亚硒酸钠浓度为12μg/mL时，培养出来的菌体全部变为红色，原因是亚硒酸钠浓度太高，亚硒酸钠表面有析出的硒单质。单质硒的形成机制可能是谷胱甘肽GSH介导的还原模式，GSH与SeO32-生成GS-Se-SG，GS-Se-SG在GSH还原酶的作用下生成GS-Se-，GS-Se-不稳定，最终分解成Se和GSH［11，12］。

表2 鼠李糖乳杆菌富硒量

3 小结与讨论

鼠李糖乳杆菌富硒作用最佳条件：38℃恒温培养、加入亚硒酸钠的时间为第10 h、最佳亚硒酸钠浓度为8μg/mL。徐颖等［7］研究发现，最佳亚硒酸钠浓度为10μg/mL，加硒时间为第6 h，培养温度为38℃，与本研究结果有差异，原因可能由于试验的浓度梯度设置的太大导致的。徐颖等［7］研究硒转化率高达85.5%，但其硒含量为197.47μg/g，本研究的硒转化率为74.72%时，富硒量高达5 901.243μg/g。徐颖等［7］的研究硒转化率非常高，但其硒含量却非常低，原因可能是将菌体烘干时未烘干至恒重，也有可能是因为加入亚硒酸钠之前乳酸杆菌生长过快，其加硒时间在细菌生长的对数期之后。曾议霆等［9］研究发现，最佳亚硒酸钠浓度为6μg/mL、加硒时间为第6 h，硒转化率达27.00%，富硒量为425.79μg/g。其硒转化率与富硒量都比较低，原因可能是其培养乳酸杆菌时的温度为36℃。本研究发现36℃与39℃培养的鼠李糖乳杆菌对亚硒酸钠的转化都比较低。朱何东等［13］研究发现，布氏乳杆菌的富硒条件：37℃恒温培养，亚硒酸钠添加量为46μg/mL，培养36 h，富硒能力为56.52%，其乳酸杆菌的种类与本研究的乳酸杆菌种类不同，布氏乳杆菌相对鼠李糖乳杆菌更能适应高浓度的亚硒酸钠，但富硒能力相对较低。宋照军［14］研究发现嗜酸乳杆菌（LA）富硒能力较强，其富硒的条件：选用番茄汁液体培养基，亚硒酸钠添加量为18μg/mL，37℃培养24 h，富硒能力为62.22%。嗜酸乳杆菌（LA）对硒的适应力也较强，富硒能力相对较高，为62.22%。亚硒酸钠浓度过高会抑制鼠李糖乳杆菌的生长，并且会在鼠李糖乳杆菌表面析出硒单质，对于鼠李糖乳杆菌中的有机硒以何种形式存在有待进一步研究。