生防菌BZJN1及化学药剂苯甲·丙环唑对白术根际土壤养分和真菌群落多样性的影响

唐 涛，王帆帆，郭 杰，郭晓亮，段媛媛，游景茂

（农业农村部中药材生物学与栽培重点实验室/湖北省农业科学院中药材研究所，湖北 恩施 445000）

白术（AtractylodesmacrocephalaKoidz.）属菊科草本植物，名列中医四大名贵药材之一，主要以干燥根茎入药，具有止汗、安胎、健脾益气的功效，临床上常用于治疗痰饮眩悸、脾虚食少、腹胀泄泻等［1］。湖北省恩施土家族苗族自治州（简称恩施州）是白术的主产区之一，有悠久的种植历史，咸丰“鸡腿白术”2007年入选中国国家地理标志产品。随着白术种植规模的不断扩大，白术根腐病在恩施州呈暴发趋势，严重威胁白术产业发展［2］。前人报道白术根腐病致病菌为尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）、半裸镰刀菌（Fusariumsemitectum）、茄病镰刀菌（Fusariumsolani）和齐整小核菌（Sclerotiumrolfsii）等［3，4］。You等［5］研究报道湖北省恩施州白术根腐病致病菌主要为角担菌（Ceratobasidiumsp.），并在白术内筛选出生防菌枯草芽孢杆菌BZJN1。比较生防菌BZJN1与化学药剂苯甲·丙环唑的防治效果发现，生防菌BZJN1在浓度为1×109CFU/mL时的防治效果超过75.27%，与30%苯甲·丙环唑推荐剂量防治效果相当［6］。中药材种植过程中的病虫害防治，不仅要保证有害生物得到有效控制，还需兼顾药材品质和自然环境安全，因此生物防治是中药材病虫害防治的最佳选择。土壤微生物是重要的土壤质量生物学指标之一，对维持土壤生命力，保障农作物正常生长具有重要意义［7］。土壤微生物数量能够一定程度上反映土壤的综合生态环境特征，土壤微生物多样性是研究土壤生态功能和土壤生态平衡的关键［8］。本研究比较了生防菌BZJN1和化学药剂苯甲·丙环唑对白术根际土壤真菌结构的影响，以期为更好地推广应用生防菌BZJN1提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试植物为咸丰“鸡腿白术”；供试菌株为BZJN1，由湖北省农业科学院中药材所植物保护室分离鉴定保存；化学药剂为30%苯甲·丙环唑乳油，购自湖南绿叶化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 田间试验设计及采样 试验点位于湖北省恩施州咸丰县小村乡白术试验田。试验田前茬作物为白术，从上年发生根腐病的白术上分离的致病菌主要为角担菌，种植过程中各项操作均一致，不使用其他化学药剂。选择一年生大小均一的白术根茎移栽，栽种前将BZJN1的发酵原液稀释为1×109CFU/mL作为处理组（BZJN1），以化学药剂30%苯甲·丙环唑2 000倍稀释液为阳性对照（HX），清水处理为阴性对照组（CK）。按照上述各药剂浓度浸种30 min，晾干后种植。试验设置每小区面积为15 m2，10株/m2，共150株，每个处理设3次重复。种植1个月后，2013年4月20日按照各药剂推荐浓度灌根，每株约50 mL，施用3次，间隔7 d。末次施药30 d后采用5点取样的方法收集白术根际中层土壤，利用土壤取样器打取地表下5～10 cm的土壤，将5点样品均匀混合收集备用。

1.2.2 土壤微生物基因组总DNA提取及PCR扩增 采用MOBIO Power Soil DNA Isolation Kit试剂盒提取白术根际土壤微生物总DNA。以1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性和片段大小，以引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩 增 真 菌ITS全长，将经过检测后的扩增产物委托给上海派森诺生物科技有限公司，对其进行高通量测序（Illumina公司MiSeq测序仪）。

1.2.3 测序文库的制备 采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库。首先对上述扩增产物进行序列末端修复，通过试剂盒中的End Repair Mix2切除DNA序列5′端的突出碱基，同时添加一个磷酸基团、补齐3′端的缺失碱基。在DNA序列的3′端添加A碱基以防止DNA片段自连，同时保证目标序列能与测序接头相连（测序接头3′端有一个突出的T碱基）。然后在序列5′端添加含有文库特异性标签（即Index序列）的测序接头，使DNA分子能被固定在Flow Cell上，采用BECKMAN AMPure XPBeads，通过磁珠筛选去除接头自连片段，纯化添加接头后的文库体系。最后，对上述连上接头的DNA片段进行PCR扩增，从而富集测序文库模板，并采用BECKMAN AMPure XPBeads再次纯化文库富集产物，通过2%琼脂糖凝胶电泳对文库做最终的片段选择与纯化。

1.2.4 上机高通量测序 上机测序前，需要先对文库在Agilent Bioanalyzer上进行质检，采用Agilent High Sensitivity DNA Kit。合格的文库只有单一的峰，且无接头。之后，采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor荧光定量系统上对文库进行定量，合格的文库浓度应在2 nmol/L以上。将合格的各上机测序文库（Index序列不可重复）梯度稀释后，根据所需测序量按相应比例混合，并经NaOH变性为单链进行上机测序。使用MiSeq测序仪进行2×300 bp的双端测序，相应试剂为MiSeq Reagent Kit V3（600个循环）。

1.2.5 下机数据质控与分析 首先运用QIIME软件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http：//qiime.org/）识别疑问序列。除了要求序列长度≥150 bp，且不允许存在模糊碱基N之外，还需剔除：①5′端引物错配碱基数＞1的序列；②含有连续相同碱基数＞8的序列。随后，通过QIIME软件（v1.8.0，http：//qiime.org/）调用USEARCH（v5.2.236，http：//www.drive5.com/usearch/）检查并剔除嵌合体序列，得到有效序列。分析真菌Alpha多样性，其评价指标主要包括Chao1、覆盖度和Shannon指数等。其中，Chao1在生态学中常用来估计物种总数；覆盖度是指各样本文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低；Shannon指数是用来估算样本中微生物多样性的指数之一。

1.2.6 土壤理化和酶活性指标测定 土壤速效养分含量直接关系到作物根系的吸收和生长以及作物产量和果实品质，是评价土壤肥力高低的最常用指标。土壤酶是土壤微生物、土壤中动植物体分泌及动植物尸体降解释放在土壤中的一类具催化活性的物质。其活性间接反映了土壤生物化学反应的剧烈程度和营养物质的循环状况，是土壤表征研究的重要指标。比较BZJN1和化学药剂对土壤理化性质和酶活的影响，可以帮助理解BZJN1促生作用的机理。土壤理化指标的测定均委托湖北省农业科学院植保土肥研究所测定。具体土壤理化指标的测定方法：速效氮测定采用凯氏定氮仪法；速效磷测定采用Bray法；速效钾测定采用醋酸铵-原子吸收光谱仪法；pH测定采用电位法。土壤中酶活性的测定方法：脲酶测定采用苯酚钠-次氯酸钠比色法；过氧化氢酶测定采用双氧水比色法；蔗糖酶测定采用甲苯-二硝基水杨酸比色法。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2007软件对数据进行处理和绘图，采用Prism 6.0统计分析软件对数据进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 数据质控和OTU聚类分析

原始数据经优化处理后，发现9个样本共测序获得405 043条高质量有效序列片段，单一样本序列数为35 414～75 224条，序列平均长度254 bp（表1）。在97%的相似度水平下对样品序列进行OTU聚类分析，对照组3个样本共鉴定得到真菌9个门19个纲59个目101个科182个属308个种，959个OTU；施用生防菌BZJN1组3个样本共鉴定得到真菌9个门21个纲65个目112个科193个属310个种，1 117个OTU；施用化学药剂30%苯甲·丙环唑组3个样本共鉴定得到真菌9个门22个纲63个目106个科179个属292个种，855个OTU（表2）。

表1 不同样品序列信息

表2 样品中真菌群落各级别分类群的数量

2.2 不同处理对真菌群落α多样性的影响

对比化学药剂苯甲·丙环唑处理、生防菌BZJN1处理和对照组样品α多样性指数，结果如表3所示，Chao1和ACE指数都是丰富度估计指数，相比于对照组，化学药剂苯甲·丙环唑处理、生防菌BZJN1处理后Chao1和ACE指数均不存在显著差异，这说明化学药剂苯甲·丙环唑处理、生防菌BZJN1处理对土壤真菌丰富度没有显著影响。Shannon指数和Simpson指数反映了物种的多样性，Shannon和Simpson指数越大，则物种多样性越高。相比于对照组，化学药剂苯甲·丙环唑处理、生防菌BZJN1处理后Shannon指数和Simpson指数均没有显著变化，说明在化学药剂苯甲·丙环唑处理、生防菌BZJN1处理后土壤真菌的物种多样性不存在显著差异。综合来看，化学药剂苯甲·丙环唑处理、生防菌BZJN1处理对土壤真菌没有显著影响。

表3 不同样品的α多样性指数

2.3 不同处理对土壤真菌组成的影响

利用RDP classifier对各样品OTU从门到属进行分类，分析供试土壤样品在各水平的真菌菌群结构。从中选取各样品在门、属分类水平上排名靠前的菌群，生成相对丰度累加柱形图。

对比化学药剂苯甲·丙环唑处理、生防菌BZJN1处理和对照组土壤样品的真菌组成，整体来看，化学药剂苯甲·丙环唑处理、生防菌BZJN1处理对土壤真菌组成没有明显影响，仅在部分菌门存在相对含量的细微差别。如图1A所示，在门水平上，对照组土壤样品中的主要真菌为子囊菌门（Ascomycota）76.34%＞担子菌门（Basidiomycota）12.49%＞接合菌门（Zygomycota）3.11%＞罗兹 菌门（Rozellomycota）0.99%＞丝 足 虫 门（Cercozoa）0.57%＞球 囊 菌 门（Glomeromycota）0.40%＞壶菌门（Chytridiomycota）0.14%。所有土壤样品中的主要真菌为子囊菌门和担子菌门，化学药剂苯甲·丙环唑处理、生防菌BZJN1处理与对照组土壤样品的真菌在组成上没有差异，仅在相对丰度上有细微差别。

在属水平上，对照组土壤样品中共检测到真菌182个属，其中种类繁杂、丰富度较低的稀有真菌类群（＜1%）为主要菌群，占全部菌群50%以上，说明土壤中存在大量有待发掘的未知微生物资源。已明确分类地位的相对丰度排前十的真菌菌属为茎点霉属（Phoma）、隐球菌属（Cryptococcus）、大孢圆孢霉属（Staphylotrichum）、被孢霉属（Mortierella）、Ilyonectria、毛壳菌属（Chaetomium）、硬皮马勃属（Scleroderma）、木霉属（Trichoderma）、淡领瓶霉属（Cadophora）和Cladophialophora（图1B）。

图1 不同样品在门（A）和属（B）水平上的真菌组成

2.4 不同处理土壤样品真菌群落差异性分析

进一步探究各处理土壤样品间真菌群落结构的差异，采用STAMP软件分析对照组与BZJN1处理组和化学药剂处理组真菌结构在门水平上的差异。如图2A所示，对照组和BZJN1处理组共有4个门类真菌，二者之间相对丰度存在显著性差异（P＜0.05），其中，担子菌门、接合菌门和壶菌门在对照组的相对丰度显著低于BZJN1处理组，子囊菌门在对照组的相对丰度显著高于BZJN1处理组。如图2B所示，对照组和化学药剂处理组共有5个门类真菌相对丰度存在显著性差异（P＜0.05），其中，担子菌门、壶菌门和罗兹菌门在对照组的相对丰度显著低于化学药剂处理组，子囊菌门和丝足虫门在对照组的相对丰度显著高于化学药剂处理组。

图2 不同样品中真菌群落结构在门水平上的差异分析

属水平的真菌多样性丰度如图3所示，化学药剂苯甲·丙环唑、生防菌BZJN1和对照组的白术根际土壤微生物菌属的相对丰度差异较大。茎点霉属、木霉属、德福霉属（Devriesia）、节枝孢属（Articulospora）、蛙粪霉属（Basidiobolus）、青霉菌属（Penicillium）和大孢圆孢霉属在对照组土壤中的相对丰度明显高于其他两组；被孢霉属、毛壳菌属、布勒掷孢酵母属（Bullera）和木霉属的相对丰度在BZJN1处理组中最高；而Ilyonectria、硬皮马勃属、淡领瓶霉属、Cladophialophora和隐球菌属的相对丰度在化学药剂苯甲·丙环唑处理组土壤中明显高于生防菌BZJN1和对照组。化学药剂苯甲·丙环唑和生防菌BZJN1处理对白术根际土壤微生物菌属组成影响较大，部分菌属丰度减少，部分菌属丰度上升。但造成这种影响的具体机制以及这种变化对土壤及白术生长的具体影响均不清楚，仍需进一步研究。

图3 不同样品中真菌群落结构在属水平的差异分析

2.5 真菌多样性和群落结构与环境因子的关系

利用冗余分析（Redundancy analysis，RDA），分析真菌10个属主要差异菌群与土壤环境因子之间的关系。结果如图4所示，白术根际土壤pH、速效钾（AK）和过氧化氢酶与土壤真菌硬皮马勃属、淡领瓶霉属、Cladophialophora和Ilyonectria呈显著正相关，与大孢圆孢霉属呈显著负相关。被孢霉属、毛壳菌属与根际土壤蔗糖酶和脲酶呈显著正相关，茎点霉属与根际土壤速效氮（AN）呈显著正相关。

图4 真菌群落与环境因子的RDA分析

由表4可知，化学药剂苯甲·丙环唑处理和生防菌BZJN1处理与对照组土壤样品的pH、速效氮、速效磷、速效钾和过氧化氢酶活性均没有显著差异，这说明生防菌BZJN1处理和化学药剂苯甲·丙环唑处理对土壤pH、速效氮、速效磷、速效钾和过氧化氢酶活性没有显著影响。化学药剂苯甲·丙环唑处理后土壤中脲酶活力显著上升，而生防菌BZJN1处理后土壤中蔗糖酶活力和脲酶活力均显著上升，表明生防菌BZJN1和化学药剂处理后均能显著提升部分土壤酶活性，可能对土壤化学反应和营养物质循环有一定的促进作用。

表4 样本土壤环境理化因子

3 小结与讨论

生防菌BZJN1处理组检测出的真菌物种略多于对照组，而施用化学药剂30%苯甲·丙环唑乳油处理组检测出的真菌物种略少于对照组。病害的发生与植株各部位微生物群落结构密切相关，微生物群落结构健康稳定，即病原菌少，有益菌多，微生物多样性高，能够一定程度上阻止或延缓病害的侵染［9］。施用生防菌BZJN1和化学药剂30%苯甲·丙环唑乳油防治白术根腐病的防效相当［6］，但就长远的影响来看，施用化学药剂30%苯甲·丙环唑乳油会逐渐减少根际土壤真菌群落多样性，从而破坏根际土壤中真菌群落的生态平衡，引发更严重的作物病害。施用生防菌BZJN1能使根际土壤真菌群落多样性逐渐增加，有利于根际土壤微生物的生态平衡。有研究表明，利用有益微生物能显著降低作物连作障碍，对作物病害防治有突出效果［10］，有益微生物对根际土壤微生物的影响可能在其中发挥着关键作用。Alpha多样性分析表明，施用生防菌BZJN1和化学药剂30%苯甲·丙环唑乳油对根际土壤真菌群落结构多样性并没有显著影响，但各真菌组成相对丰度差异十分明显。白术根际土壤样品中的主要真菌为子囊菌门、担子菌门和接合菌门，这一结果与谢玉清等［11］检测的大蒜根腐病发生后根际土壤真菌群落结构相似。施用生防菌BZJN1后，白术根际土壤中担子菌门、接合菌门和壶菌门相对丰度显著提升，宋旭红等［12］发现感染根腐病后黄连根际土壤中子囊菌门和壶菌门的相对丰度显著高于健株土壤，这与本研究结果相悖，可能与研究对象及致病菌的差异有关。在属水平上，白术根际土壤真菌群落的优势菌属为茎点霉属和隐球菌属，这一结果与向立刚等［13］测定烟柱及唐彬彬等［14］测定三七根际土壤真菌结构存在差异。施用生防菌BZJN1和化学药剂30%苯甲·丙环唑乳油处理组和对照组均有相对丰度占优的菌属，这说明施用生防菌BZJN1和化学药剂30%苯甲·丙环唑乳油对白术根际土壤真菌群落的结构存在明显影响。微生物群落结构与多样性受多种因素影响，包括气候条件、土壤类型、人类活动以及营养条件等［15］。本研究所取样品均来自大田，即使同一块田地每株植物的生长环境也不尽相同，因此导致本研究中同类样本组内差异较大。虽然同组样本存在一定差异，但各处理组真菌群落的总体变化趋势一致，能够反映田间施用生防菌BZJN1和化学药剂30%苯甲·丙环唑乳油对白术根际土壤真菌群落结构及多样性的影响情况。前期研究发现施用生防菌剂BZJN1和化学药剂30%苯甲·丙环唑乳油对白术根际土壤细菌群落结构变化的影响不大，但生防菌BZJN1对白术根际土壤细菌群落存在一定有利影响［16］。而本研究中施用生防菌BZJN1对白术根际土壤真菌群落结构多样性也有一定促进作用，这一结果为生防菌BZJN1的进一步推广应用提供了参考依据。