一株防病促生细菌HPS-211菌株的分离与初步鉴定

黄 薇，谢媛圆，金利容，周剑雄，熊又升，曾祥国

（湖北省农业科学院，a.植保土肥研究所/农业农村部华中作物有害生物综合治理重点实验室/农作物重大病虫草害防控湖北省重点实验室；b.经济作物研究所，武汉 430064）

草莓属多年生草本植物，可鲜食，营养价值高，风味好，能制成多种草莓深加工产品，如果酱、果干等，深受广大消费者的喜爱［1］。中国的草莓产业在过去十年间发展迅速，根据联合国粮农组织（FAO）最新统计，2020年中国草莓种植面积为12.72万hm2，在世界草莓种植面积中占比最高。中国草莓种植主要采用一年一栽的连作模式，导致生产上连作障碍严重，带来极大的损失，如草莓苗的萎蔫、倒伏或是草莓不挂果，严重时甚至会造成整垄死苗，目前主要依靠土壤熏蒸和化学防治等多手段进行田间管理［2］。土壤环境的连作障碍、草莓苗的病虫害发生较重以及农药的使用量过多等问题，极大地影响了草莓的品质和鲜食安全［3］，草莓灰霉病就是其中的重要影响因素之一。草莓灰霉病对草莓生长和采摘前后都存在较大危害，其病原物为灰葡萄孢（Botrytiscinerea）［4］，以菌丝体、分生孢子随病残体或以菌核形式在土壤内越冬，翌年通过气流、浇水或农事活动等途径传播［5］，分生孢子在温度0～35℃，相对湿度81%以上均可萌发［6，7］，且无抗病品种，导致该病害易发难防。

植物病害的发生不仅与病原、环境有关，亦与植物自身状态密切相关，植物根际促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）作为一类可定殖于植物根际系统并能促进植物生长的细菌，其通过促进植物生长来提高植物抗逆性的报道较为常见［8］，其种类繁多，不仅对植物有显著促生长作用，对抑制土传病害的发生、增强植物抗逆胁迫能力、改善土壤生态环境等方面也有重要作用［9-11］。周贝贝［12］在草莓根际筛选中得到4株PGPR菌株，具有产蛋白酶、解磷和拮抗病原菌的能力。防病和促生作用是生防菌株应用于生产实践必备的两个功能，也是用于筛选拮抗菌株的重要指标，本试验希望筛选具备促生和拮抗真菌功能的PGPR菌株，拟以梯度稀释法从草莓连作和休耕土壤中分离得到可培养的细菌单菌落，通过与真菌对峙共培养筛选，了解其对真菌的拮抗作用并对其进行效果评价，应用于盆栽试验，验证其促生效果并进行分子鉴定，为新型微生物农药的研制和应用提供更多资源。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病原菌：小麦赤霉病菌（Fusariumgraminearum）HB-11、灰 霉 病 菌（Botrytiscinerea）B05.10、黄连炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）H8-20、稻曲病菌（Ustilaginoideavirens）QJ-1由湖北省农业科学院植物病理团队和水稻团队提供；棉花黄萎病菌（VerticilliumdahilaeKieb.）V991、棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporium）均由湖北省农业科学院植物病理实验室分离和保存。

蔬菜品种：番茄、辣椒、茄子种子均购于农资公司。培育蔬菜所用的基质土为中国农业科学院研发的育苗专用基质土。草莓品种为红颜，由湖北省农业科学院经济作物研究所韩永超课题惠赠。

供试培养基为马铃薯葡萄糖培养基（PDA）和牛肉膏蛋白胨培养基（NA）及相应的固体培养基。苯丙氨酸解氨酶（PAL）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、过氧化氢（H2O2）试剂盒和叶绿素含量测定试剂盒来自于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 草莓拮抗真菌菌株的分离纯化 采用五点取样法，2021年从武汉市黄陂区禾盛吉农场采回8年连作不结果和休耕2年的草莓田土样，取根际周边10 cm、深度约10 cm的土样以及草莓灰霉菌典型发病株若干份，分别装在采样袋中带回实验室，备用。

根际细菌的分离：取10 g根际土，加入90 mL无菌水悬浮液，25℃、180 r/min振荡10 min，获得10-1稀释液，依次梯度稀释，取0.1 mL的10-2、10-3、10-4、10-5稀释液涂布于NA平板，置于28℃培养箱中培养，48 h后挑取颜色、光泽、边缘光滑度和厚度不同的单菌落于新的NA平板上进行划线培养，对所得菌株编号并斜面保存，备用［13］。

1.2.2 分离细菌对植物病原真菌的拮抗活性的初筛 采用平板对峙法［14］，将病原菌菌饼接种至PDA平板中央，在平板四面距平板中央各2.5 cm的地方平行划线接种待测分离细菌菌株，于25℃培养箱中培养。每个处理3次重复，2 d后检查各菌株的抑菌效果。

1.2.3 分离细菌对草莓灰霉菌拮抗活性的复筛 将初筛的菌株分别接种于NA中，于28℃、130 r/min的摇床上培养48 h。在PDA平板中央接种培养72 h的灰霉菌菌饼（直径5 mm），用无菌的打孔器在距离中央2 cm处三点对称打孔，每孔中分别注入0.1 mL待测菌株的菌液，以接种等体积的NB为对照，每个处理3次重复，平板置于28℃恒温培养箱中培养，待对照平板中灰霉菌菌丝即将长满全皿时，测量各处理组的抑菌带大小。

1.2.4 细菌HPS-211抑菌谱的测定 参照Jeong等［15］的方法并稍作改进，制备细菌HPS-211发酵3 d的无菌滤液，将无菌滤液混入冷却至55℃左右的PDA培养基中，使其终浓度为10%，倒成平板。以混入相同体积的NA为对照。在PDA平板中央接入待测病原菌菌饼，28℃倒置培养。每处理4次重复。待对照组菌丝几乎长满培养皿时，采用十字交叉法，测量各组的病原菌菌落直径，计算相对抑制率［16］。

1.2.5 HPS-211对3种植株生理及生长指标的测定 番茄、辣椒、茄子的种植采用常规管理方法，生防菌液的制备同“1.2.4”。以接种等体积的NA为对照，每处理12株植株，3次重复。将植株放在（25±2）℃温室中培养，光照∶黑暗=14 h∶10 h，30 d后，通过测定植物的株高、根重、生物量（鲜质量和干质量）以及含水量，分析接种细菌对植物生理生长的影响。取植物第三片真叶，采用PAL、叶绿素、丙二醛、过氧化氢酶试剂盒分别测定叶片中的苯丙氨酸解氨酶含量、叶绿素含量、丙二醛含量和过氧化氢酶的含量。

1.2.6 细菌对草莓灰霉病的影响 待草莓苗长至4～5片真叶后，将其从基质移栽至塑料盆里。设置4个处理：①病原菌B05.10+提前3 d接种细菌；②病原菌B05.10+同时接种细菌；③病原菌B05.10+NA；④清水对照。灰霉病原菌B05.10接种到PDB中，28℃、130 r/min振荡培养5 d，经4层纱布过滤得到1×108CFU/mL的孢子悬浮液，对草莓植株顶叶喷施孢子悬浮液。

制备HPS-211悬浮液（2×108CFU/mL），接种时对草莓幼苗进行灌根，每株接种20 mL。以接种等体积的NA为对照，每个处理22株草莓苗，3次重复。草莓植株均置于（25±2）℃温室中培养，光照：黑暗=14 h∶10 h。接种病原菌B05.10后，从接种后15 d开始调查草莓植株的发病严重度，并计算相应的病情指数。

1.2.7 细菌的分子鉴定 参照沈萍等［17］的方法，对细菌进行革兰氏染色。使用OMEGA细菌基因组提取试剂盒提取细菌的总DNA，采用16SrDNA基因通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进 行PCR扩增。反应体系：PCR preMix 12.5μL、正引物1.0μL、反引物1.0μL、DNA 2.0μL和ddH2O 8.5μL；扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性60 s、58℃退火90 s、72℃延伸60 s，变性、退火和延伸循环35次；72℃继续延伸10 min；4℃保存。取少量PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。所得序列在NCBI的GenBank中进行比对分析，利用MEGA 7.0软件构建系统进化树。

1.3 数据分析

采用SPSS17.0软件进行Duncan’s多重比较，检验组间差异显著性，数据表示为平均数±标准差。

2 结果与分析

2.1 草莓灰霉病拮抗真菌的分离和初筛

由表1可知，从草莓8年连作和休耕土样中分离得到了465株细菌，经平板对峙初筛，得到若干株可拮抗赤霉菌或灰霉菌的细菌，其中5株在平皿上可以同时拮抗赤霉菌和灰霉菌，可以进一步对其拮抗活性进行研究。

2.2 草莓拮抗菌株的复筛

拮抗活性复筛（表2）发现，抑菌带宽超过5 mm的菌株共有9株，其中细菌HPS-211和HPS-32对灰霉病菌B05.10的抑制活性最强，形成的抑菌带宽达10 mm左右，且对赤霉菌HB1-1的抑制活性也较强，本试验选择HPS-211作为后续研究菌株。

表2 拮抗细菌的复筛

2.3 抑菌谱的测定

由表3可以看出，HPS-211的无菌滤液在10%浓度下对6种供试病原菌有不同程度的抑制作用，其中，对赤霉菌HB-11抑制活性较弱，而对其他5种真菌生长的抑制率为29.47%～57.50%，对大丽轮枝菌的抑制率最高。细菌发酵液对小麦赤霉菌HB-11的抑制率最低，为6.06%，其次为黄连炭疽菌ES-3、灰霉菌B05.10、棉花枯萎菌S3-8和稻曲菌QJ-1，细菌发酵液对棉花黄萎病菌V991的抑制率达57.50%。细菌发酵液对6种真菌菌落生长组间存在极显著差异。

表3 10%浓度的HPS-211发酵液对真菌的影响

2.4 细菌对真菌的拮抗作用

如图1所示，细菌HPS-211对小麦赤霉菌HB-11的生长基本无影响，菌落和气生菌丝的生长均无抑制作用；对灰霉菌B05.10有一定的抑制作用，但随着培养时间的延长，对菌落生长的抑制作用逐渐减弱；对棉花黄萎病菌、黄连炭疽菌、棉花枯萎病菌和稻曲菌的菌落生长可产生较为明显的抑制，且可持续一段时间。其中，对棉花黄萎病菌的抑制效果最为明显。

图1 细菌HPS-211对6种真菌的拮抗作用

2.5 细菌对植物生理及生长指标的影响

由表4可知，接种细菌HPS-211 30 d后，对3种植物的生理指标均产生了一定的影响。与对照相比，3种植物叶片中的叶绿素含量均有提高，但差异不显著；苯丙氨酸解氨酶含量在3种植物中均有所下降，番茄和茄子中的苯丙氨酸解氨酶含量均显著低于对照，且以番茄叶片中的苯丙氨酸解氨酶含量下降幅度最大；接种细菌HPS-211对番茄的株高和单株鲜重有促进作用，平均分别提高了14.5%和26.9%，但对辣椒的株高无显著影响，且鲜重略有下降，对茄子株高和鲜重的影响均不显著。

表4 接种细菌HPS-211 30 d后对3种植物生理及生长指标的影响

2.6 细菌对草莓灰霉病的影响

由表5可知，接种细菌HPS-211和灰霉病菌的草莓苗与仅接种灰霉菌的草莓苗相比，在病情指数上都存在显著性差异，且差异均达极显著水平。接种15 d后的病情指数已出现显著性差异，接种25 d后仅接种灰霉菌草莓苗的病情指数是接种细菌HPS-211和灰霉菌处理的2倍多。根据调查结果，推测接种期间细菌HPS-211对草莓植株的影响能持续发挥作用。

表5 接种25 d内菌株HPS-211对草莓灰霉病病情指数的影响

2.7 细菌HPS-211对草莓生长的影响

如图2所示，与清水对照相比，草莓植株在接种细菌HPS-211后，能正常开花、结果，表明接种细菌HPS-211并不影响草莓的挂果，且草莓植株的株高、叶色、叶面积等指标还出现较大的改观。接种细菌HPS-211 25 d后，喷施灰霉菌孢子悬浮液且同时接种细菌HPS-211的草莓植株平均株高为28.4 cm，叶绿素含量平均为2.82 mg/g；清水对照草莓植株平均株高约为24.7 cm，叶绿素含量平均为2.63 mg/g，喷施B05.10+HPS-211处理的株高和叶绿素含量均极显著高于清水对照（表6）。而未接种细菌HPS-211的草莓叶片呈深绿色，植株叶片的成熟度更高，老化程度高于接种细菌HPS-211的植株。

表6 草莓植株的株高和叶绿素含量

图2 喷施接种灰霉菌孢子液和清水对照的草莓植株

2.8 HPS-211的分子鉴定

HPS-211菌株的菌落为淡黄色，表面平整干燥，呈半透明状态，边缘规则，菌落略有异味。经革兰氏染色判断其为革兰氏阴性菌，为杆菌，经芽孢和鞭毛染色镜检后，发现有鞭毛结构，但无芽孢。通用性引物27F/1492R经基因扩增后发现，HPS-211菌株的16SrDNA序列长度为1 423 bp，经Blast分析表明，其与偶氮假单胞菌（Pseudomonasazotoformansstrain，KGGI16）的16SrDNA序列具有99%的相似度。系统发育进化树（图3）显示，菌株HPS-211与偶氮假单胞在同一分支上，将该菌株初步鉴定为偶氮假单胞菌。

图3 细菌HPS-211的系统进化树

3 小结与讨论

3.1 细菌HPS-211的生物学特性和抑菌效果

细菌HPS-211为革兰氏阴性杆菌，其菌落为淡黄色，表面干燥呈半透明状态，边缘规则，菌落略有异味。经染色镜检后，发现有鞭毛，无芽孢。细菌HPS-211对赤霉菌的抑制作用不明显，但对灰霉菌存在一定的抑制作用，对峙试验中菌液可对真菌形成明显的抑菌圈，且细菌发酵液对灰霉菌的生长抑制率为29.47%，对6种真菌，除赤霉菌外，均存在一定的抑制效果，对棉花黄萎病菌的生长抑制作用最强。由于稻曲菌和黄萎病菌属于生长较缓慢的真菌，可能易受到外界环境的扰动，而对赤霉菌和灰霉菌这类生长速度较快的真菌影响效果则不显著，随着培养时间的延长，气生菌丝仍会覆盖到接种细菌的平皿部位。

3.2 HPS-211菌株对番茄叶片中多种酶类的影响

HPS-211菌株对番茄的生理影响最为显著，处理后番茄叶片中的苯丙氨酸解氨酶、过氧化氢酶、丙二醛含量均低于对照，其中，苯丙氨酸解氨酶含量极显著低于对照，而叶绿素含量高于对照，但差异不显著。苯丙氨酸解氨酶是一类与植物抗逆性相关的酶类，它的活性与木质素、花青素、类黄酮等次生代谢物质的积累呈显著性正相关［18］。本研究表明，细菌HPS-211能显著提高番茄的株高，且极显著提高番茄的鲜重，是否能提高番茄的抗逆性还有待进一步的研究。

植物在正常状态下，植物中活性氧的产生和清除过程呈平衡状态，当受到虫害或是机械损伤时，体内活性氧代谢系统平衡会受影响，细胞膜脂结构遭到破坏。MDA含量是植物细胞膜脂过氧化的一个重要指标，MDA含量的大量增加，表明体内细胞受到较严重的破坏［19］。梁郸娜等［20］发现蚜虫侵染黄瓜后，抗感品系叶片中MDA含量均有上升。接种细菌HPS-211 30 d后，番茄叶片中的MDA与对照相比有所降低，但二者之间差异未达显著性水平，表明接种细菌HPS-211后并未对植物细胞膜脂结构造成明显的干扰。在正常状态下，植物中H2O2的产生和清除过程呈平衡状态，H2O2含量与植物的抗病防御反应密切相关［21］。过氧化氢酶可催化过氧化氢转化为氧气和水，降低H2O2对植物体产生的伤害，是生物体防御反应体系的重要酶类之一。在一定程度内，H2O2含量越高，过氧化氢酶的分解速度越快。接种细菌HPS-211后降低了番茄叶片中过氧化氢酶的含量，表明接种细菌HPS-211可能并不会诱发番茄的抗病防御。

3.3 细菌HPS-211对几种植物的促生效果

促生菌可以通过直接机制，如产生植物生长素或是促进养分的吸收和利用，或通过间接机制，如影响酶活性，促进营养竞争和产生系统抗性等，进而促进植物的生长［22］。通过接种HPS-211菌株到番茄、辣椒、茄子和草莓上，发现与对照相比，其对番茄和草莓植株的株高、叶色、叶面积和根系均有较显著的促进作用，株高更高，叶色更加鲜嫩翠绿，叶面也更宽大。对辣椒的促生作用不显著，但提高了辣椒叶片的叶绿素含量，叶色更加有光泽，接种HPS-211可能提高了辣椒叶片的光合效率，促进光合作用。但接种细菌HPS-211对茄子的促生作用不明显。

叶绿素是植物进行光合作用的基础物质，也是反映植物光合能力和健康状态的重要指标，对作物的产量和品质有显著影响［23］，有研究表明在病原菌的胁迫下，植物的叶绿素含量与植物抗性呈正相关［24］。与清水对照相比，草莓在接种细菌HPS-211后，也能正常开花、结果，表明接种细菌HPS-211不影响草莓的挂果。对照草莓植株叶片的成熟度更高，老化程度高于接种细菌HPS-211的植株。细菌HPS-211对其他植物是否也存在类似的促生作用，还有待进一步的研究来证实。