CRISPR-Cas9技术介导蔬菜作物遗传改良研究进展

万丽丽，王转茸，汤 谧，张学军，曾红霞，任 俭，张 娜，孙玉宏，熊建顺，朱志坤

（1.武汉市农业科学院，武汉 430065；2.新疆农业科学院哈密瓜研究中心，乌鲁木齐 830091；3.新疆农业科学院海南三亚农作物育种试验中心，海南 三亚 572014；4.武汉市蔡甸区农业农村局，武汉 430199）

蔬菜作物富含纤维、维生素、微量元素、抗氧化剂及矿物质等重要营养，是人类合理膳食中不可或缺的重要来源。然而气候环境的变化带来的病虫害、缺素以及干旱、盐碱、渍害等对蔬菜生产及供应造成潜在的风险［1，2］，迫切需要育种者从高产、稳产、营养品质以及生物和非生物胁迫抗性等方面选育新品种以适应生产及市场需求。农作物品种的选育经历了驯化育种和杂交育种等常规育种阶段并选育得到具有适应性的优良品种。随着长期的人工选择，常规育种的缺点不断凸显，主要表现在过于依赖自然等位基因的变异使得可利用的遗传种质资源狭窄；改良目标性状的同时由于连锁累赘效应带来众多不利性状，严重降低育种效率［3］。新兴农作物生物技术的开发及应用为高效率精准的品种选育提供了技术支撑。序列特异性核酸酶（SSNs）如锌指核酸酶（ZFNs），转录激活类效应核酸酶（TALENs）和CRISPR-Cas基因编辑技术能够在特定DNA位点产生双链断裂（DNA double-strand breaks，DSBs）。在真核生物中，DSBs的修复机制主要有2种：①非同源末端连接（Non homologous end joining，NHEJ），在没有同源修复模板时，NHEJ修复能够使断裂染色体发生不准确的连接，断裂的位置一般会通过修复而出现少量碱基的缺失或插入，实现基因敲除；②同源重组修复（Homology directed repair，HDR），在存在同源序列情况下，HDR能够以其为修复模板，使同源序列能够精确定点地替换或者插入相应的剪切位点［4］。虽然ZFNs和TALEN技术已经应用并获得了农作物基因编辑的产品，但是构建过程繁琐且花费昂贵，限制了技术的广泛应用［5，6］。CRISPR-Cas基因编辑技术是近年发展起来的，以其操作简单、准确高效的优势成功地应用到农作物的遗传改良中。

根据Cas编码基因的核心序列差异，CRISPRCas系统分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3种不同类型，其中Ⅰ型和Ⅲ型系统需要多个Cas蛋白形成复合体才具有完整的剪切活性［7］。Ⅱ型系统相对简单，除crRNA和tracrRNA以外，仅需要一个Cas9蛋白就可以完成对特定外源DNA的切割，Cas9蛋白由RuvC结构域和HNH核酸结构域组成，分别对目标外源DNA双链中的一条行使切割功能［8］。目前常用的CRISPR-Cas9系统就是在Ⅱ型的基础上改造获得，该系统具有一条引导作用的sgRNA（single-guide RNA）和一个Cas9蛋白。其中sgRNA由一段与靶基因同源配对的20 bp RNA片段（crRNA）和一段60 bp的RNA片段（tracrRNA）组成。CRISPR array转录成为前体RNA转录本（precursor RNA transcript，pre-crRNA）。一个非编码的反式激活CRISPR RNA（crRNA）与前体RNA转录本杂交，与Cas9蛋白相结合，加工得到成熟的crRNAs。实际操作是将sgRNA序列和Cas9编码基因重组质粒导入受体细胞，在sgRNA引导下，Cas9蛋白靶向切割目标双链DNA，形成DSBs，继而根据DNA修复的方式得到基因失活或者基因获得的突变表型。

1 CRISPR-Cas基因编辑系统

1.1 常用的CRISPR-Cas类型

来自化脓链球菌的SpCas9是常用的Ⅱ型CRISPR-Cas系统的关键核酸酶，在sgRNAs作用下识别PAM序列，结合靶位点的互补序列，切割双链DNA，在PAM上游3 bp处产生双链断裂［9］。为了拓展Sp-Cas9识别不同PAM序列，开发出SpCas9变体如识别5′-NG、5′-GAA和5′-GAT［10］，金黄色酿脓葡萄球菌（Staphylococcus aureus，Cas9）SaCas9识 别5′-NNGRRT［11］，嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus，Cas9）StCas9识别5′-NNAGAAW［12］，脑膜炎双球菌（Neisseria meningitidis，Cas9）NmCas9识 别 5′-NNNNGATT［13］，空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni，Cas9）CjCas9识别5′-NNNVRYM［14］，CasX或Cas12e识 别5′-TTCN［15］。type VI CRISPR-Cas系 统 中Cas13（C2c2）蛋白介导高效干扰靶向RNA病毒应用到植物抗病毒研究中［16］。

1.2 单碱基编辑系统

单核苷酸突变是农作物中许多重要农艺性状发生变异的遗传基础，单碱基的变异会导致氨基酸替换或者蛋白质翻译终止，使得基因功能发生改变，从而获得优良的等位基因与优异性状。CRISPR技术衍生的单碱基编辑工具能够高效实现基因组中靶序列编辑活性窗口内C＞T或A＞G的转变。单碱基编辑系统能够在不产生双链断裂的前提下，将nCas9和胞嘧啶脱氨酶（APOBEC1）、尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）构成的胞嘧啶单碱基编辑器（CBEs）、nCas9切口酶和腺嘌呤脱氨酶融合的碱基编辑器（ABEs）以及双碱基编辑器（Dual base editing technology），由起导航作用的gRNA引导至靶位点发挥碱基替换作用，分别能够对目标位点实现高效胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）到鸟嘌呤（G）以及实现C-G到T-A和A-T到G-C的同时突变［17，18］。

1.3 引导编辑（Prime editing，PE）

引导编辑系统是由向导RNA（prime editing guide RNA，pegRNA）Cas9核酸切口酶（Cas9 nickase，H840A）和逆转录酶组成。原理是Cas9切口酶在pegRNA上的sgRNA指引下，切割DNA单链，形成3′末端（3′flaps）和5′末端（5′flaps）两段序列，而5′末端会被具有5′核酸外切酶活性FEN1和具有5′核酸外切酶活性的EXO1蛋白切割。而3′末端通过反转录pegRNA 3′-端的PBS（引物结合序列Primer binding site，PBS）可以与切割断点前的互补序列识别配对，逆转录酶（M-MLV RT）以pegRNA上PBS序列后的人工设计序列为模板进行逆转录，将目标序列直接聚合到切口的DNA链上［19］（图1）。目前PE系统在植物里处于起步阶段，能够在不引入双链断裂DSB和供体DNA模板的前提下实现靶标位点的插入、缺失和所有12种类型点突变［20］。为了提高PE系统的适用性，研发人员认为可以优化pegRNA参数包括PBS和RT模板的长度，以促进非编辑链切口形成；优化植物载体的元件如启动子、核定位信号等以利于PE系统的高效转化利用；将现在常用的双启动子系统简化为紧凑的单转录单元（Single transcript unit，STU），利用一个启动子启动用于精确编辑的多基因如nCas-M-MLV-RT融合蛋白、pegRNA和切割非编辑链的sgRNA表达框；利用直接转运到细胞内部的核糖核蛋白复合体（Ribonucleoprotein complex，RNP）提高PE高效基因编辑；利用多样化的Cas切口酶（SpCas9-NG、ScCas9、SaCas9等）扩展PAM区类型，增加PE在植物中应用的可塑性［21，22］。

图1 Prime editing引导编辑系统构成与作用机理

2 CRISPR-Cas基因编辑系统在植物中的递送

CRISPR基因编辑技术在植物应用中面临的技术瓶颈是如何顺利地将编辑元件导入植物细胞中。常用的递送方法有利用基因枪、农杆菌介导的组织培养、PEG介导原生质体转化［23］。目前最常用的方法是利用农杆菌介导的方式将CRISPR-Cas等序列特异性核酸酶和选择标记表达框导入受体植物细胞，在选择性培养基中再生获得稳定整合的转基因植株。然而以质粒为基础的递送方法会因为植物种类或者基因型的愈伤组织诱导和再生效率极低，限制了此技术的应用。因此发展无需转化的CRISPR-Cas高效递送方法，建立DNA-free植物基因编辑技术，有助于加速作物育种进程、降低监管成本、推动基因编辑作物的产业化应用。利用CRISPRCas9核糖核蛋白复合物（RNPs）转化原生质体获得DNA-free的研究已在拟南芥、烟草、生菜、水稻、玉米和小麦等作物上成功实现［24-26］，但是PEG转化细胞后再生过程长且获得完整植株难度大。基因枪法虽然能够将T-DNA转化到植物细胞中，但是转化效率低，容易产生染色体断裂继而导致DNA重组的发生［27］。T-DNA表达载体也可以通过PEG介导或者电转化法实现原生质体转化，但是转化效率和再生效率非常低，限制了该技术的应用。病毒载体系统是外源基因体内递送和瞬时表达的理想工具，是转基因稳定表达系统的重要补充。在植物领域应用中，尽管植物病毒表达系统广受关注，但是CRISPR-Cas核酸酶包括转录顺式元件达5～6 kb时，远超出已知大多数植物病毒载体1～2 kb的包容极限。因此，大多数研究者只能在Cas9超表达的植株中利用各种病毒如烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）［28，29］、烟 草 花 叶 病 毒（Tobacco mosaic virus，TMV）［30］、豌豆早褐病毒（Pea early-browning virus，PEBV）［28］、大麦条纹花叶病毒（Barely stripe mosaic virus，BSMV）［31］、狐尾草花叶病毒（Foxtail mosaic virus，FoMV）［32］、甜菜丛根病毒（Beet necrotic yellow vein virus，BNYVV）［33］和单链DNA白菜卷叶病毒（Cabbage leaf curl virus，CLCV）［34］介导sgRNAs的传递并获得基因编辑的组织或植株。由于大多数植物不同基因型的转化再生效率存在差异，因此一种不通过组织培养的新型gRNA和Cas9传递系统对农作物基因编辑育种至关重要。2020年浙江大学李正和团队表达出一种工程化的植物负链RNA（NSR）病毒，将CRISPR-Cas9表达框插入植物细胞质弹状病毒大麦黄条纹花叶病毒（Barely yellow striate mosaic virus，BYSMV）和苦苣菜黄网弹状病毒（Sonchus yellow net rhabdovirus，SYNV）载体，并在gRNA序列两侧连接tRNAGly前体序列，在细胞内源tRNA加工机制下对病毒转录的gRNA末端进行精确剪切；当重组病毒接种本氏烟时能有效形成系统侵染并表达Cas9/gRNA分子，产生可高达90%的靶向编辑。由于该重组载体可以通过汁液摩擦传代，维持了CRISPR-Cas9稳定表达和高效编辑；研究中发现该弹状病毒通过成比例地扩展毒粒子的长度来包容病毒基因组中较大外源基因片段的插入，为Cas9在基因组的稳定性和载体承载能力提供了一种可能［35］。

此外，Lei等［36］将CRISPR-Cas9系统直接转化花粉母细胞获得再生植株。Daniel F.Voytas团队利用植物分生组织重要的发育调控因子（Development regulators，DRs）包 括WUSCHEL（WUS）、SHOOT MERISTEMLESS（STM）、ipt的不同组合，诱导分生组织产生茎及小叶，进而生根培养，促使芽状增殖体形成稳定传代的转基因植株；之后将Cas9转基因烟草地上分生组织全部去除后，用含有DRs和PDS sgRNA表达单元的农杆菌注射切口部位，最终获得可以稳定遗传的基因编辑后代，并在部分基因编辑后代中已经检测不到外源转基因插入［37］。上述研究成果可以为不依赖于组织培养的基因编辑技术应用提供技术支撑。

如图2所示，组装的CRISPR-Cas9 RNPs通过PEG介导方法转化原生质体。包含CRISPR-Cas组件的T-DNA通过农杆菌介导方法转化到植物细胞（外植体如子叶、下胚轴；小孢子细胞以及完整植株体），最后原生质体或者组织再生成基因编辑植株。在病毒诱导的基因编辑系统中，sgRNA与RNA移动元件整合到烟草环斑病毒（TRV）RNA2，将TRV RNA1和TRV RNA2转化农杆菌注射到Cas9超表达的植株，sgRNAs表达后在组织中传递靶向突变目标基因。通过denovomeristem诱导系统验证，去除Cas9超表达植株分生组织后，将表达形态建成调控因子（MRs）和sgRNA表达的载体注射到剪枝的位置。MRs能够诱导基因编辑分生组织从头形成，最后从发育的芽再生得到基因编辑植株。

图2 CRISPR-Cas9系统递送到植物的方法

3 CRISPR-Cas9在蔬菜作物中的应用

目前CRISPR-Cas9已经在主要粮食作物中应用，解决了产量提升、品质改良和抗性增强等育种资源匮乏的难题。随着50多种蔬菜作物全基因组测序的实现，一些重要表型和农艺性状如抗病性、果实形状、颜色、口感、熟性、风味以及雌雄花分化等关键基因的功能得以诠释，为CRISPR-Cas9技术成功应用于蔬菜育种提供了丰富的基因资源。

3.1 CRISPR-Cas9改良蔬菜作物生物胁迫抗性

利用基因编辑系统提高植物对病毒的抗性，主要采用2种思路：一是促使病毒基因组中编码外壳蛋白的基因或者病毒复制子发生基因突变，二是敲除参与作物抗病毒途径的关键基因。马铃薯Y病毒属基因组连接蛋白（Virus genome-linked protein，VPg）与植物真核翻译起始因子4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）的结合在Y病毒属病毒侵染植物过程中起关键作用，通过突变eIF4E的关键位点能影响病毒-植物的互作，并介导植物对病毒的抗性［38］。在黄瓜中利用CRISPR-Cas靶向突变感病elF4E基因型的N′和C′末端，获得非转基因的纯合植株表现对黄瓜脉黄化病毒（Cucumber vein yellowing virus）的免疫以及西葫芦花叶病毒（Potyviruses Zucchini yellow mosaic virus）和木瓜环斑花叶病毒-W（Papaya ring spot mosaic virus-W）的抗性［39］。根据植物双生病毒甜菜曲叶病毒基因组的编码区和非编码区序列信息，设计不同组合CRISPR-sgRNA表达载体，瞬时转化至烟草、拟南芥叶片，检测转化不同组合的叶片表面病毒积累量，得出相比对编码区的突变，对非编码区的突变既能降低甚至抑制病毒的复制能力，又能减少病毒变体的产生［40］。真菌性病害如霜霉病和白粉病是导致蔬菜产量和品质下降的重要原因［23］。拟南芥的DMR6（Downy mildew resistant）基因属于以Fe（Ⅱ）作为辅因子的2-氧代戊二酸加氧酶，参与了水杨酸稳态，超表达能提高对霜霉病的感病性［41］。利用基因CRISPR-Cas9使番茄中的AtDMR6同源基因突变，所得的DMR6突变体对假单胞杆菌、疫霉属菌、黄单胞菌属具有抗病性。Mlo1（Mildew resistant locus 1）编码膜结构相关蛋白，是白粉病敏感型基因。利用CRISPR-Cas9使番茄中的Mlo1基因突变，产生对白粉病（Oidium neolycopersici）的抗性［42］。PMR4（Powdery mildew resistance 4）编码胼胝质合成酶，能对白粉菌产生抗性。蔬菜真菌性病害尖孢镰刀菌能够引发 枯 萎 病［43］。利 用CRISPR-Cas9敲 除 番 茄Solyc08g075770基因提高对枯萎病的敏感性［44］。灰霉病菌属于气传病害，可以随空气、水流以及农事操作等方式传播，是设施蔬菜普遍发生且难以防治的真菌性病害。番茄果实采收后尤其容易感染灰霉病，利用CRISPR-Cas9技术使MAPK3（Mitogen-activated protein kinase 3）基因突变能够增强对灰霉病的抗病性［45］。丁香假单胞菌（Pseudomonassyringae）是重要的植物细菌致病菌，能够感染50多种农作物。在侵染过程中，先定植于植物叶片表面，再利用鞭毛装置运动到叶片背部气孔，通过Ⅲ型分泌系统（TypeⅢsecretion system，T3SS）将T3SS效应蛋白注射到宿主细胞，进而导致宿主致病。在拟南芥中JAZ2（Jasmonatezim domain protein 2）基因能够表现对丁香假单胞菌的抗性，研究者利用CRISPR-Cas9使番茄JAZ2基因的C′末端茉莉酸相关结构域（JAZ2Δjas）突变，得到JAZ2抑制子植株，表现出对丁香假单胞菌的抗性［46，47］。

3.2 CRISPR-Cas9改良蔬菜作物非生物胁迫抗性

油菜素内酯相关的抗性基因（Brassinazole resistant 1，BZR1）调控着油菜素甾醇（Brassinosteroid，BR）反应。利用CRISPR获得的bzr1突变体以及BZR1超表达的突变体研究得出，BZR1基因参与调控植物的耐冷途径［48］。SlMAPK3（Solanum lycopersicum mitogen-activated protein kinase 3）基因参与了番茄的干旱胁迫反应，保护植物细胞膜免受过氧化损伤，利用基因编辑技术使上述基因突变，能够获得耐冷和耐旱的新种质资源［49］。

3.3 CRISPR-Cas9改良蔬菜作物除草剂抗性

杂草是影响蔬菜产量和品质的重要胁迫因素，生产上通常使用选择性除草剂来防治。为了获得抗除草剂的瓜果类蔬菜，并应用于田间生产，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，使西瓜中除草剂靶标基因乙酰乳酸合成酶（Acetolactate synthase，ALS）定向突变，获得抗除草剂的西瓜种质［50］。利用胞嘧啶单碱基编辑技术（Cytidine base editing，CBEs）使番茄和马铃薯ALS编码区产生C-T的转换，导致氨基酸的突变，在番茄中高达71%精准编辑的植株表现为对氯磺隆除草剂的抗性，并且在番茄和马铃薯中分别有12%和10%的编辑植株无转基因成分［51］。列当属植物是一类植物专性寄生的杂草，需要宿主根系释放植物激素独脚金内酯（Strigolactones，SLs）促进种子萌发。利用CRISPR-Cas9突变番茄中类胡萝卜素合成途径中类胡萝卜素双加氧酶8（Carotenoid Cleavage Dioxygenase 8，CCD8），所得突变体中SLs合成基因表达量降低，导致植株体内SLs含量下降，进而抑制专性寄生列当属杂草种子的萌发［52，53］。

3.4 CRISPR-Cas9改良蔬菜作物的品质

蔬菜的品质育种目标包括改良感官和营养品质。感官品质主要是果实大小、颜色、纹理和质地。番茄子房心皮室的数目决定了50%果实大小的遗传变异，而心皮室数目由多个QTLs所决定［54］。利用CRSIRP-Cas9对SlCLV3的启动子区编辑，产生了一系列顺式调控的等位基因，不同SlCLV3转录水平导致植株果实大小、花序形态、心室数目的差异［55，56］。果实的颜色和质地是蔬菜作物重要的感官性状。研究者根据不同区域人群对蔬菜感官的需求，应用CRISPR-Cas技术实现定向育种。利用CRISPR-Cas工具靶向突变八氢番茄红素合成酶基因（Phytoene synthase 1，PSY1）、MYB转录因子（MYB12）、花青素酶基因（Anthocyanin 2，ANT2）可以获得黄色、粉色以及紫色的番茄［57-59］。营养品质的改良主要涉及含糖量、维生素以及生物强化复合物等。碳水化合物和维生素是重要的营养物质。多个基因参与了蔗糖和类胡萝卜素（在人体中维生素前体A能够被吸收并转化为维生素A）的合成与代谢。比如利用CRISPR-Cas敲 除MPK20（Mitogen-activated protein kinase 20）基因，能够阻断蔗糖代谢途径中多个基因的转录［60］。生物强化被定义为利用现代生物技术手段提高植物对矿物质的吸收、转移和代谢能力，有益于人体健康的微量元素富集于食物中，长期食用能有效预防心血管疾病和癌症［61］。花青素［62］、苹果酸酯［63］、γ-氨基丁酸GABA［64］以及番茄红素［65］等被认为是生物强化物质，利用CRISPR-Cas9技术调控代谢途径的关键基因能够在果实中富集这类营养物质，比如编辑GABA合成途径中的多个基因能够使番茄中GABA的含量增加11～12倍［66］；调控铝酸盐转 运 子（Aluminum-activated malate transporter 9，ALMT9）能够改良番茄果实中苹果酸盐的含量［63］。对生菜维生素C合成限速酶基因（LsGGP1和Ls-GGP2）的上游表达调控元件（uORF）精准编辑能够提高mRNA翻译水平，使得维生素C含量显著提高［67］。利用CRISPR-Cas9技术敲除7-脱氢胆固醇还原酶的特定亚型SL7-DR2，能够导致成熟番茄果实中7-DHC含量大量增加，通过紫外线处理编辑番茄果实能够促使7-DHC转化为维生素D3，1个番茄中含量相当于2个中等大小鸡蛋或28 g金枪鱼，由于该维生素D合成途径也存在于茄子、马铃薯、辣椒等其他茄科植物中，因此，可以采用类似方法提高维生素D含量［68］。除了上述提高蔬菜作物有益人体健康的营养成分外，同时还可以通过降低对人类食用有风险物质的含量来提高品质。在马铃薯块茎中糖苷生物碱（SGAs）如α-茄碱和α-卡茄碱含量过高会严重影响口感，并导致食用风险，利用CRISPR-Cas9技术敲除马铃薯SGA生物合成途径中类固醇16α-羟化酶（St16DOX）基因，获得无SGA的优良种质资源［69］。茄子多酚氧化酶（Polyphenol oxidase genes，PPOs）是引起果实酶促褐变的主要原因，对茄子与果实氧化相关的3个多酚氧化酶基因（SmelPPO4、SmelPPO5、SmelPPO6）同时突变能够显著降低茄子果实的褐化［70］。

3.5 CRISPR-Cas9在蔬菜作物驯化中的应用

高产和适宜大规模农业生产的栽培作物都经历了长期的驯化和选育。随着作物遗传改良，遗传多样性、抗病和抗环境胁迫能力逐渐降低，通过传统杂交的方式将野生种的优良性状再次导入栽培种耗时费力且常伴随遗传累赘。利用CRISPR技术可以修饰野生种中重要的驯化基因，快速获得产量、品质、抗逆性俱佳的新作物，这个过程被称为从头驯化（Denovodomestication）。中国科学院遗传与发育生物学研究所许操研究组和高彩霞研究组合作，选用天然耐盐碱和抗细菌疮痂病的野生醋栗番茄（Solanumpimpinellifolium）作为基础材料，用基因编辑技术精准靶向开花的光周期敏感性、株型和果实同步成熟控制基因SP和SP5G的编码区、果实大小控制基因SlCLV3和SlWUS的顺式调控元件和维生素C合成酶基因SlGGP1的上游开放阅读框（Upstream open reading fragment，uORF）［71］，在保证野生番茄对盐碱和疮痂病天然抗性的前提下，消除了开花的光周期敏感性，突破了栽种地域限制，同时将醋栗番茄开花晚、坐果稀的无限生长型（Indeterminate）的株型变成了双有限生长型（Double determinate）的紧凑株型，提高了坐果率、果实成熟的同步性和收获指数。对小肽基因SlCLV3及其信号途径下游基因SlWUS的顺式调控元件和SlGGP1上游开放阅读框的编辑使野生番茄果实变大，维生素C含量升高［55］。美国冷泉港霍华德休斯医学研究所与康奈尔大学博伊斯汤普森研究所合作，对富含维生素和抗氧化剂的番茄近缘种印加酸浆（Physalispruinosa）又名红菇娘进行从头驯化。利用CRISPR基因编辑技术敲除SELF-PRUNING5G基因使植株形态发生改变，停止发芽和生长叶子转而生长更多的花和果实，最后使得果实数量增加50%；突变CLV1基因后果实重量增加24%。传统育种可能需要数十年才能完成改良，而基因编辑技术在不到2年内通过两个关键的驯化基因突变获得了优良品种［72］。巴西维索萨联邦大学领衔的研究团队将野生番茄中存在的优良性状与农艺学上所需性状相结合，选择当前番茄品种中决定产量和品质的6个基因进行基因编辑，成功地改变了野生番茄的形态、果实大小、数量和营养价值，尤其是番茄红素积累量相比广泛栽培种Solanumlycopersicum提高了500%［73］。

3.6 优化CRISPR-Cas载体系统获得非转基因植株的方法

自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，转基因农作物新品种研发从抗虫、抗除草剂等第一代产品向改善营养品质和提高产量的第二代产品转变，并显示良好的市场开发前景。但是转基因过程引入了外源DNA片段可能会影响插入位点相邻基因的表达［5］。CRISPR-Cas9能直接对目标性状基因进行修饰，之后通过自交或者杂交剔除外源基因以消除转化外源片段的安全顾虑。蔬菜作物种类繁多，有的以基因型杂合形式存在，自交以及杂交不亲和，生育期长，基因组复杂度高，如三倍体或多倍体等以营养体繁殖。为能获得无转基因成分的CRISPR-Cas9基因编辑的植株，研究人员开发了2种方法：①基于位点特异性重组酶（Site-specific recombinase flippase，Flp）方法［74］。Flp能够识别34 bp长的FRT序列。Flp/FRT系统能有效剔除转基因苹果以及葡萄中的T-DNA表达组件［75-77］；②依赖于Cas9蛋白的剪切机制。在CRISPR-Cas9载体的LB和RB端合成一段靶序列，命名为剪切靶位点（Cleavage target sites，CTS）。当CRISPR-Cas9载体转化到植物中时，Cas9蛋白剪切内源基因靶位点的同时也能剪切CTS，最终将T-DNA区域的外源片段从基因组中释放，从而获得T-DNA free的植株［75］。

4 CRISPR-Cas基因编辑技术在蔬菜育种中的挑战及展望

得益于蔬菜作物全基因组测序数据的公开以及功能基因组学的迅速发展，CRISPR-Cas9技术已经在蔬菜育种中应用。但未来CRISPR-Cas技术的应用面临两个挑战：一是准确选择靶向突变的关键基因。通常重要的农艺性状是复杂的数量性状，编辑单个基因并不会产生表型的变化，因此利用CRISPR-Cas介导的靶位点特定插入以及染色体重组方法能够聚合多个突变的等位基因［78-80］。利用基因编辑技术阻断特定基因的表达会导致植物适应性降低，因此需要对基因功能进行高效特异的精确调控。植物的顺式作用元件（Cis-regulatory elements，CREs）是非编码DNA序列，常决定了基因的转录，其中基因调控区单核苷酸的突变、插入、缺失、倒位以及表观遗传变异与作物的驯化息息相关［81］，利用CRISPR-Cas对基因调控区突变能够产生数量性状的变异，导致多样化的表型。目前蔬菜作物CREs的基因编辑还处于起步研究阶段，接下来需要将不同突变型的CREs所产生的表达量变化同相应的表型关联起来，通过对CREs的基因编辑获得丰富的育种资源；二是建立适应于不同类蔬菜的基因组编辑技术。虽然目前能通过农杆菌或者基因枪介导CRISPR-Cas元件转化外植体，PEG或者电穿孔法介导原生质体转化，但是开发具有普适高效的遗传转化技术应用于蔬菜作物的基因编辑仍存在较大难度，CRISPR-Cas组件遗传转化效率以及转化组织再生成植株的能力成为技术应用的限制因素。为提高农杆菌转化以及转化后再生能力，可利用革兰氏阴性细菌如丁香假单胞细菌的分泌系统T3SS在农杆菌中表达，将三型效应子T3Es如AvrPto、AvrPtoB、HopAO1运送到细胞中，通过阻断植物PTI反应提高农杆菌介导的转化效率［82］。在CRISPR-Cas表达系统中同时超表达植物形态建成的调控基因LEAFY COTYLEDON1、LEAFYCOTYLEDON2、WUSCHEL（WUS）、BABYBOOM（BBM）、GRF4（GROWTH-REGULATINGFACTOR4）和互 作因 子GIF1（GRF-INTERACTINGFACTOR1）促使转化后的再生［83-85］。