鸡肝脏中能量代谢相关膜蛋白基因及其上游转录因子的筛选与鉴定

申 杰，李 刚，黄 涛，皮劲松，龚炎长，潘爱銮，吴 艳，张 昊，付 明，梁振华

（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省农业科技创新中心/动物胚胎与分子育种湖北省重点实验室，武汉 430064；2.湖北农垦对外经济交流中心，武汉 430064；3.华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430064）

鸡肝脏在能量代谢、消化和免疫方面发挥着多种作用，易受到氧化应激，如急性热应激和空腹应激［1-4］，直接影响其生产性能。跨脂质分子层膜蛋白（Tran membrane protein，TMEMs）代表一类横跨脂质双分子层的膜蛋白［5］，可以在各种细胞膜上扩散，包括线粒体、内质网、溶酶体和高尔基体膜，并控制特定物质在生物膜上的运输。因此，TMEMs参与细胞的生理生化过程，对细胞功能的维持具有重要作用。

近年来，研究发现TMEMs可作为癌症生物标 志 物（如TMEM45A、TMEM116、TMEM207和TMEM213）［6］，也可作为抑癌基因（如TMEM25和TMEM7）［7，8］，还可作为促癌基因（如TMEM158和TMEM14A）［9，10］。TMEMs在 肿瘤 研 究领 域 相对 较多，且具有重要功能。本研究利用前期鸡肝脏转录组数据［11］，挑选了8个TMEMs基因，检测其在肝脏中的表达变化，预测及鉴定其上游转录因子。

1 材料与方法

1.1 试验动物

将海兰褐随机分为限饲组（n=10）和自由采食组（n=10）。对于限饲组，每只鸡每天投料量40～50 g，而对于自由采食组，料槽不断料。饲养的肉仔鸡和蛋仔鸡在6周龄时处死，采集肝脏组织保存。

1.2 总RNA的提取与反转录

使用TRIzol试 剂（Invitrogen公司，Carlsbad，CA）提取总RNA。通过ND-2000型分光光度计（Nano-Drop公司）和1%琼脂糖凝胶电泳评估RNA浓度和纯度。使用Prime Script RTReagent Kit（宝日医生物技术（北京）有限公司）反转录，1μg总RNA与1.0μL gDNA Eraser和2μL 5×gDNA Eraser缓冲液混合，42℃孵育2 min，以消除基因组DNA。将1μL Prime Script RT酶混合物、4μL 5×Prime Script缓冲液、1μL RT引物混合物和4μL Raze-free水加到混合物中，37℃保温15 min，85℃保温5 s，然后4℃终止反应。cDNA产物保存于-20℃。

1.3 RT-qPCR

在Bio-Rad CFX96系统（美国Bio-Rad公司）上使用SuperReal PreMix（SYBR Green）（天根生化科技（北京）有限公司）分析基因的表达水平，所设计引物见表1。每个样品3个重复，以鸡GAPDH基因为参照，使用2-ΔΔCT方法计算表达量。

表1 RT-qPCR检测的引物序列

1.4 细胞的培养

鸡胚原代肝细胞的分离与培养参照文献［12，13］。孵育15 d的鸡胚30个，取出肝脏并切碎，用1×PBS溶液洗涤，然后用胶原酶IV（BIOFROX公司）在37℃消化20 min。100目和500目筛过滤细胞，室温下800 r/min离心5 min，每次过滤后用1×PBS溶液洗涤3次。在细胞中添加10%胎牛血清（FBS）（AusGeneX公司）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基。将细胞密度调整为5×105个/mL，细胞铺板后，37℃下5%CO2培养。

DF1细胞在添加10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM中培养，在37℃下5%CO2孵育。

1.5 质粒的构建与转染

利用Q5高保真DNA聚合酶扩增TMEM86A启动子区（NC_006092.4）不同长度DNA片段（P1-P5），分别插入荧光素酶报告载体pGL3-BasicNheⅠ和XhoⅠ酶切位点。将ARNT（NM_204200.1）、CREB1（NM_204450.2）和SP1（NM_204604.1）基因的编码序列分别克隆到pcDNA3.1载体中，重组载体引物见表2。使用LipofectamineTM3000（Invitrogen公司）对细胞进行瞬时转染。对于24孔板（2.5×105个/孔）培养的细胞，在LipofectamineTM3000中，加入荧光素酶报告质粒500 ng、pcDNA3.1重组质粒500 ng和pRLTK质粒50 ng转染细胞。处理48 h后，使用双荧光素酶报告系统检测荧光比值。所有结果均来自至少3次独立试验。

表2 用于重组载体构建的引物序列

2 结果与分析

2.1 TMEMs基因在肝脏中的表达

选取8个TMEMs基因，分别检测在蛋鸡和肉鸡肝脏中的表达水平。由图1可知，TMEM45A、TMEM51、TMEM86A、TMEM97和TMEM154基因在肉鸡中的表达量显著（P＜0.05）高于蛋鸡，表明2种类型鸡的肝脏内细胞代谢状态存在差异。此外，为比较相同品种的不同采食方式对TMEMs基因的表达影响，设置了自由采食组和限饲组，检测结果见图2。与自由采食组相比，限饲组肝脏TMEM135、TMEM199和TMEM214表达水平显著下调（P＜0.05）。与自由采食组相比，限饲组只有TMEM86A基因表达水平显著升高（P＜0.05），提示饥饿状态可能是导致TMEM86A基因上调表达的原因。

图1 TMEMs基因在蛋鸡和肉鸡肝脏中表达水平

图2 TMEMs基因在自由采食组和限饲组肝脏中的表达水平

2.2 TMEM86A基因启动子区调控区域的鉴定

将鸡TMEM86A基因转录起始位点作为+1，将其5′侧启动子序列作为调控区域进行PCR扩增，并截短为5个片段构建pGL3重组载体。在鸡胚肝脏细胞中，荧光素酶报告基因试验结果显示pGL3-P5到pGL3-P3的荧光素酶活性相对稳定，当截短到pGL3-P2时，其荧光素酶活性明显下降，表明-906 bp至-615 bp之间的序列中存在重要转录因子；当再次截短后pGL3-P1的荧光素酶活性上升，表明在-615 bp至-296 bp之间的序列中存在抑制性的转录因子。推测TMEM86A基因的启动子受多种转录因子调控（图3）。

图3 荧光素酶报告基因试验检测TMEM86A基因启动子活性

2.3 靶向TMEM86A基因转录因子的筛选与验证

根据Jaspar和TRANSFAC软件的结果，预测7个靶向TMEM86A启动子的转录因子，分别为SP1、CREB1、E2H4、EGR1、ASCL1、HIF1A和ARNT。通过RT-qPCR检测转录因子在自由采食组和限饲组之间的表达水平，表明SP1、CREB1和ARNT在两组中表达存在差异（图4）。限饲处理促进了SP1和ARNT的表达，抑制了CREB1 mRNA的表达。在DF1细胞中利用双荧光素酶报告基因系统分析转录因子对TMEM86A基因表达活性的影响，结合超表达转录因子和共转染pGL3-P5试验，发现SP1显著促进pGL3-P5荧光素酶活性（图5a），CREB1显著促进pGL3-P5的相对荧光素酶活性（图5b），但ARNT对pGL3-P5荧光素酶活性变化不显著（图5c）。

图4 预测转录因子在限饲组与自由采食组间的mRNA表达

图5 超表达SP1、CREB1和ARNT检测p GL3-P5片段的荧光活性

3 小结与讨论

本研究从TMEMs基因在鸡肝脏中的表达检测结果中，发现限饲处理会促进TMEM86A基因上调表达，提示该基因可能参与饥饿应激。给小鼠喂食高脂肪食物可以降低脂肪组织溶酶浆原水平，并增加跨膜蛋白TMEM86A含量，当TMEM86A基因被敲除以后，线粒体氧化代谢增强，能量消耗提高，表明其是参与能量代谢的重要基因［14］。蛋鸡在日常生产过程中，经常因为喂料不均、过少造成能量摄入不足，从而导致长时间停产或减产，因此探究TMEM86A基因的生物功能具有重要意义。

根据TMEM86A基因上游序列，使用Jaspar网站和TRANSFAC网站预测了7个潜在转录因子，在自由采食组和限饲组中RT-qPCR结果显示，ARNT、SP1和CREB1 3个转录因子存在差异表达。CREB通过调节哺乳动物中的糖原和脂质代谢，在脂肪组织和肝脏中发挥着至关重要的作用［15］。与生长缓慢的鸡相比，生长迅速的鸡肝脏中CREB1 mRNA和蛋白表达水平显著（P＜0.05）升高［16］，高脂肪饲料喂养的雄性大鼠肝脏中CREB1表达上调［17］。限饲组肝脏中CREB1的表达下调，CREB1通过靶向TMEM86A基因的启动子，调控TMEM86AmRNA的表达水平。除了CREB1，发现SP1能影响TMEM86A的启动子活性，转录因子SP1在多种组织中广泛表达，在细胞黏附、侵袭、迁移和血管生成中发挥重要作用［18］。本研究表明在肝脏细胞中SP1和CREB1通过靶向TMEM86A基因，共同参与鸡肝脏的能量代谢过程。