基于正交设计的西洋梨‘Conference’愈伤组织诱导研究

杨 立，伍 涛，刘 政，程寅胜，李谢雨，聂显双，秦仲麒

（湖北省农业科学院果树茶叶研究所/湖北省梨工程技术研究中心，武汉 430070）

梨（PyrusL.）属于蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科（Maloideae）或梨亚科（Pomideae）［1］，是世界五大水果之一，深受人们青睐。随着现代水果产业的发展，消费市场对梨综合品质的要求不断升级。因此，利用基因工程手段定向培育农艺性状优良的品种是现代果树育种长期关注的重点。

遗传转化是植物基因工程的重要环节，高效、稳定的转化受体系统是进行果树遗传转化研究的关键。尽管梨树中山梨、砀山酥梨等品种已建立了遗传转化再生植株体系［2，3］，但普遍存在转化效率低的问题。愈伤组织是已分化的细胞回到脱分化的分生细胞状态，更易于接受外源基因，在理论上作为受体的转化效率更高。随着愈伤组织在果树遗传转化功能分析中的成功应用［4-6］，有必要在‘Conference’梨中建立一套高效且可持续扩大培养的愈伤组织无性系。

正交设计是研究与处理多因素试验的一种科学方法，可以实现最少的试验次数达到与大量全面试验等效的结果［7］。因此，本研究以‘Conference’为试材，通过正交设计研究不同外植体和生长调节剂组合对愈伤组织形成的影响，以期筛选得到最佳试验方案，建立一套成熟稳定的梨无性培养系，为后期开展遗传转化的基因功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为西洋梨品种‘Conference’无菌苗，为华中农业大学洪霓教授赠予，后实验室继代保存。在无菌条件下，选择长势良好的植株作为试验接种的对象，分别剪取叶片（5 mm×5 mm）、叶柄（约0.5 mm）及带芽的茎段（5～10 mm）为外植体。

1.2 正交试验设计

采用3因素3水平正交试验，3因素为外植体和加入培养基中的TDZ和IBA，3水平因素与水平见表1［7］。

表1 L 9（34）正交试验因素与水平

1.3 培养条件

基本培养基为MS，含6.5 g/L琼脂、30 g/L蔗糖，pH为5.8～5.9，培养温度（25±0.2）℃，24 h暗培养。每个处理设置4～5个培养瓶，每瓶各接种10～15个外植体。培养35 d后统计各处理的外植体愈伤组织诱导率。试验数据采用SPSS19软件分析。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导率统计

对愈伤诱导情况进行统计，因为部分处理组的脱分化率不在30%～70%，为提高显著性检验的准确度，对诱导率进行反正弦平方根转换［8］（表2）。

表2 正交试验试验结果统计

经过外植体、TDZ、IBA 3因素3水平共9个组合的正交试验，不同组合对诱导愈伤组织再生影响各不相同。组内因素水平极差值（R）反映了该因素对试验结果的影响程度。由表3可知，设计的3个因素对愈伤组织诱导作用主次关系为B＞A＞C，即培养基中TDZ的浓度＞外植体的类型＞IBA浓度。根据各因素平均值（Ki）的大小，可得出最优组合为A1B3C3，即以茎段为外植体，置于培养基MS+2.0 mg/L TDZ+0.5 mg/L IBA的组合条件下培养，愈伤组织的诱导率最高。

表3 愈伤组织正交试验结果的直观分析（单位：%）

2.2 愈伤组织诱导结果的方差分析及多重比较

2.2.1 试验结果方差分析 试验结果sin-1X的方差分析见表4。因素B对试验结果的影响具有显著性（P＜0.05），在本试验组合中，TDZ浓度的高低能显著影响梨组织的愈伤组织形成，同时，外植体类型（A）和生长调节剂IBA（C）对愈伤组织是否形成的影响不显著。

表4 正交试验结果的方差分析

2.2.2 不同水平间的多重比较 不同水平之间多重比较的结果见表5，A1和A3、A3和A1、B1和B2、B1和B3、B2和B1、B3和B1水平之间呈显著差异（P＜0.05）。但平均诱导率B3（62.21%）比B2（57.12%）高5.09个百分点，C3（63.85%）比C1（37.84%）高26.01个百分点，尽管B3和B2、C3和C1之间无显著差异，但可以获得更多的愈伤组织，因此因素B、C的最佳选项为B3和C3水平。

表5 不同水平间的多重比较分析

3 小结与讨论

植物的再生途径有多种方式，可通过根［9］、胚胎和子叶［10］、原生质体［11，12］再生，或愈伤组 织再分化［13，14］等。王关林等［15］认为，用于基因转化的受体系统，其再生率一般80%～90%。其中，愈伤组织是经历了脱分化的分生细胞，分裂周期短、扩大培养后易获得大量受体细胞，因此，具有更明显的转化优势。

在本试验中，TDZ和IBA对试验结果有影响，诱导率由大到小依次为B3、B2、B1，C3、C2、C1，证明在适宜浓度范围内，愈伤诱导率与培养基中TDZ或IBA的浓度呈正比。尽管生长素在细胞脱分化过程中起主要作用，但当配合一定浓度细胞分裂素时，诱导效果更明显。例如，在IBA（C）浓度为0.1 mg/L时，B3C1组合中愈伤组织诱导率最高，为77.78%，当IBA浓度为0.5 mg/L时，诱导效率达到100%。本研究获得了‘Conference’梨大量的愈伤组织，以用于植物瞬时表达分析或优化构建植物再生转化体系，为后期深入开展基因功能研究奠定了良好基础。