草地贪夜蛾热休克蛋白Hsp70的生物信息学分析

刘 芳，张志刚，方 伟，王开梅，2，王月莹

（1.湖北省农业科学院/湖北省生物农药工程研究中心/国家生物农药工程技术研究中心/农业农村部微生物农药创制重点实验室/湖北省农业科技创新中心生物农药分中心，武汉 430064；2.洪山实验室，武汉 430070）

热休克应答（Heat shock response）是生物体受热激诱导所进行的一种转录和翻译的调控，暂时性抑制一些参与细胞正常功能的蛋白合成，同时启动一组保守的蛋白——热休克蛋白（Heat-shock proteins，Hsp）的合成。热休克蛋白最早于1962年在昆虫中被发现［1］，是机体为响应环境胁迫而产生的一类重要的分子伴侣蛋白，直接参与细胞内蛋白质从初始链的聚合到多亚基复合体层叠、组装等多个生物过程［2，3］。在昆虫中，热休克蛋白广泛表达，在增强昆虫对非生物和生物胁迫的耐受以及调节正常发育过程中均发挥重要作用［4，5］。根据分子质量和功能，昆虫热休克蛋白可分为4大家族：小热休克蛋白（Small heat-shock proteins）、Hsp60、Hsp70和Hsp90［5］。多种昆虫的热休克蛋白可被非生物胁迫诱导表达和调控，包括极端温度［6-8］、紫外线辐射［9，10］、农药［11，12］、重金属［13，14］、干燥［15-17］、饥饿［18，19］和缺氧［20-22］，以及寄生虫［23，24］、病原体［25，26］和高种群密度［27］等生物伤害。研究昆虫热休克蛋白和温度等环境条件的关系，有利于了解昆虫生长发育对环境因素的依赖规律。

草地贪夜蛾属于鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）灰翅夜蛾属（Spodoptera），又名秋黏虫，广泛分布于美洲大陆热带和亚热带地区，是玉米和其他主要经济作物重要的迁飞性害虫之一［28-30］。具有寄主广泛、适生范围广泛、迁飞速度快、繁殖能力强、防控难度大等特点，在国际上有“无敌破坏王”之称，是联合国粮农组织全球预警的迁飞性农林业重大害虫［31］。它们主要为害水稻、玉米、甘蔗高粱、大豆等186种重要农作物［32，33］。2016年起，草地贪夜蛾散播至非洲、亚洲各国，并于2019年1月起出现在中国，发生面积超过3 333.33 km2［34］，已在多国造成巨大的农业损失。其危害的潜在风险较大，今后在中国有可能常态化发生［33］，将对华南、黄淮海及北方玉米主产区的玉米生产和中国粮食生产安全构成严重威胁［35］。

春夏季节气温升高，导致草地贪夜蛾向北迁移，而秋季时，随着光照时间逐渐缩短且温度逐渐降低，草地贪夜蛾又会回迁［36］。在大范围的迁飞定居过程中，草地贪夜蛾需要面对各种环境的胁迫。不良环境胁迫因子会对昆虫的生存、发育与繁殖产生威胁。高温会导致昆虫蛹羽化率低和寿命短等现象［37，38］；低温则影响昆虫的存活率［39］。为了应对不良环境，昆虫能够通过改变虫体结构和物质能量代谢以适应环境胁迫。大量研究表明，昆虫响应环境胁迫的机制与特殊生理生化物质密切相关，包括热休克蛋白、海藻糖、抗氧化酶等小分子保护剂［40，41］，但目前国内有关草地贪夜蛾响应环境胁迫的分子机制研究较少。

近年来，转录组和基因组数据的可用性极大地促进了越来越多来自不同昆虫物种的热应激蛋白基因的鉴定，并促进了它们的功能研究［8，12，42-44］。然而，对于具有强破坏性的害虫——草地贪夜蛾的hsp基因信息仍然十分有限。据报道，草地贪夜蛾不同大小的热休克蛋白均可以被高温条件诱导而大幅上调表达［45］，说明热休克蛋白可能参与草地贪夜蛾对抗大范围迁飞定居过程中面对的各种环境胁迫。Hsp70蛋白是目前为止研究最多、最深入的热休克蛋白家族成员之一，具有应激诱导表达特性，其表达量和昆虫生长发育及应对环境胁迫的能力密切相关。以草地贪夜蛾的Hsp70为研究对象，利用生物信息学的方法分析其理化性质、二级结构、三级结构、蛋白质修饰位点以及同源性等，为研究草地贪夜蛾热休克蛋白的功能和寻找草地贪夜蛾的防治靶点提供参考。

1 材料与方法

1.1 基因序列材料

从美国国家生物技术信息中心（NCBI）DNA序列数据库中查找获得草地贪夜蛾热休克蛋白Hsp70的核苷酸完整编码序列（Completed CDs）和氨基酸序列，登录号分别为MN735776.1和QNN88712.1。选取另外12种鳞翅目昆虫以及1种鞘翅目、2种半翅目、1种双翅目昆虫和斑马鱼（Daniorerio）的Hsp70核苷酸序列和氨基酸序列作为对照参考，核苷酸序列和氨基酸序列登录号：柞蚕（Antheraea pernyi，GU945198.1，ADI50267.1）、天 蚕（Antheraea yamamai，AB179657.1，BAD18974.1）、蜡螟（Galleria mellonella，MG992397.1，AXY94835.1）、棉铃虫（Helicoverpaarmigera，HM593518.1，ADP37711.1）、苜蓿夜蛾（Heliothisviriplaca，GQ199477.1，ACS72236.1）、甘 蓝 夜 蛾（Mamestrabrassicae，AB251895.1，BAF03555.1）、烟 草 天 蛾（Manducasexta，AY220911.1，AAO65964.1）、黏虫（Mythimnaseparata，EU306518.1，ABY55233.1）、菜粉蝶（Pierisrapae，HQ647013.1，ADV03160.1）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua，FJ862049.1，ACQ78180.1）、斜 纹 夜 蛾（Spodopteralitura，HQ012004.2，ADV03160.1）、粉纹夜蛾（Trichoplusiani，DQ845103.1，ABH09732.1）、赤拟 谷 盗（Triboliumcastaneum，MK000439.1，QCI56580.1）、大豆蚜（Aphis glycines，JQ340173.2，AFO70211.1）、桃 蚜（Myzuspersicae，MF509827.1，AWN00453.1）、黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster，AY084193.1，AAL89931.1）和 斑 马 鱼（Daniorerio，BC036370.2，AAH36370.1）。

1.2 数据分析方法

本研究所用生物信息学分析工具如表1所示。多序列比对采用Mega-X［46］软件的Muscle［47］算法，比对结果通过trimAl软件［48］的automated方法对齐，随后，通过Mega-X［46］软件采用最大似然法（Maximm likelihood）建立系统发育树，bootstrap值［49］重复计算1 000次。

表1 生物信息学分析方法

2 结果与分析

2.1 草地贪夜蛾Hsp70蛋白的理化性质和亲疏水性分析

ProtParam分析结果显示，草地贪夜蛾Hsp70蛋白由651个氨基酸残基组成，分子式为C3099H4982N882O985S24，分子质量为71 126.41 u，理论等电点（PI）为5.47，为弱酸性蛋白，负电荷残基总数（Asp+Glu）为93，正电荷残基总数（Arg+Lys）为82，不稳定指数（Instability indexⅡ）为39.68，归类为稳定蛋白。Hsp70蛋白中氨基酸含量最高的为丙氨酸（Ala），占比9.4%（61/651），其次为甘氨酸（Gly），占比为8.8%（57/651）（图1）。

图1 草地贪夜蛾Hsp70蛋白的氨基酸组成

利用ProtScale工具分析Hsp70蛋白的亲疏水性，结果显示蛋白最小值为-3.767，最大值为2.300，为亲水蛋白（图2）。

图2 草地贪夜蛾Hsp70蛋白的亲水/疏水分析

2.2 草地贪夜蛾Hsp70蛋白的二级结构和三级结构分析

利用NetSurfP 3.0预测草地贪夜蛾Hsp70蛋白的二级结构。该蛋白中37.48%的氨基酸形成α螺旋（Alpha helix）（244个氨基酸残基），26.11%形成延伸链（Extended strand）（170个氨基酸残基），21.66%形成无规则卷曲（Random coil）（141个氨基酸残基）（图3）。

图3 草地贪夜蛾Hsp70蛋白的二级结构预测

利用SWISS-MODEL预测了草地贪夜蛾Hsp70蛋白的三级结构。该蛋白三维建模最高全局模型质量估计值（GMQE）为0.79，表明结构预测较为可靠（＞0.7）。参考蛋白为绿藻（Chlamydomonasrein-hardtii）的热休克蛋白Heat shock protein 70A（SMTL ID：7sqc.391），两者氨基酸序列一致性为70.05%。如图4所示，该蛋白主要结构为α螺旋，其次为延伸链和无规则卷曲，与二级结构预测结果一致。

图4 草地贪夜蛾Hsp70蛋白的三级结构预测

2.3 草地贪夜蛾Hsp70蛋白的信号肽跨膜区及跨膜结构预测分析

利用SignalP-6.0和TMHMM工具，分析了草地贪夜蛾Hsp70蛋白的信号肽跨膜区及跨膜结构，结果表明，3个蛋白均不具有信号肽以及跨膜结构（图5）。

图5 草地贪夜蛾Hsp70蛋白质的信号肽跨膜区和跨膜结构域分析

2.4 草地贪夜蛾Hsp70蛋白的系统发育分析

从NCBI数据库中选取另外12种鳞翅目昆虫，以及1种鞘翅目、2种半翅目和1种双翅目昆虫Hsp70的核苷酸序列和氨基酸序列作为对照参考，与草地贪夜蛾Hsp70蛋白的氨基酸序列进行同源性分析，结果如图6所示，草地贪夜蛾的Hsp70与鳞翅目昆虫甜菜夜蛾和斜纹夜蛾亲缘关系较近，但与鳞翅目昆虫蜡螟、粉纹夜蛾和黏虫亲缘关系较远。

图6 草地贪夜蛾Hsp70蛋白的系统发育进化树

3 小结与讨论

热休克蛋白是一组在生物进化过程中高度保守的蛋白质分子家族，在许多昆虫物种中已经发现了大量的热休克蛋白基因。热休克蛋白是在环境胁迫下生存的重要调节剂，也是正常发育和滞育的关键调节剂。在不良环境下昆虫体内的热激蛋白通过稳定细胞结构或消解错误蛋白来维持正常生命活动，提高生物细胞对应激源的耐受力，阻止细胞凋亡［55，56］。Hsp70家族蛋白参与由环境胁迫而引起刺激信号转导、氧化应答、抗冻、热休克和金属结合等过程。从分子水平上检测热休克蛋白基因表达变化是一种检测农药等污染物的良好手段。同时随着全球气候变暖问题的日益严重，农业害虫温度适应能力增强，造成活动范围的扩大，热休克蛋白的研究不但为深入开展害虫抗逆适应性机制研究奠定理论基础，而且可以为害虫的综合治理提供帮助。

草地贪夜蛾的入侵和迅速扩散已在中国造成巨大的经济损失，严重威胁中国农业及粮食生产安全，然而其如何抵抗环境胁迫的相关机理研究仍有欠缺。本研究选用的Hsp70蛋白基因来自草地贪夜蛾，该物种的hsp70基因共编码20种651个氨基酸，其中，丙氨酸含量最高，色氨酸含量最低。该蛋白不稳定指数为39.68，属于稳定的亲水蛋白，且该蛋白不存在信号肽和跨膜结构域。在同源性分析中选取12种鳞翅目昆虫，以及1种鞘翅目、2种半翅目和1种双翅目昆虫的Hsp70蛋白序列与草地贪夜蛾比对，经Mega-X比对，建立系统发育树，发现草地贪夜蛾Hsp70蛋白与鳞翅目昆虫甜菜夜蛾和斜纹夜蛾亲缘关系较近，而与鳞翅目昆虫蜡螟、粉纹夜蛾和黏虫的物种亲缘关系较远。以上结果为进一步研究草地贪夜蛾热休克蛋白的功能和寻找草地贪夜蛾的防治靶点提供了一定的理论基础。