白杨素对胰脂肪酶的抑制作用及机制

张国文，黎 沙，朱 苗

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

肥胖是一种慢性疾病，与艾滋病、吸毒、酗酒并列为世界性四大医学社会问题[1]。胰脂肪酶(Pancreatic Lipase，简称PL)是胰腺合成和分泌的重要脂解酶，它能将膳食甘油三酯水解成单甘油酯和脂肪酸，然后被重新吸收并最终合成为人体所需的脂肪[2]。过多的脂肪蓄积导致的肥胖容易引起糖尿病、脂肪肝、高血脂、高血压、骨关节炎等多种疾病[3-4]。抑制胰脂肪酶活性是防治肥胖及其并发症最有效的方法之一，然而，临床药物如奥利司他等对人体都会产生一定的副作用，因而限制了其临床应用。因此，开发高效、低毒的新型胰脂肪酶抑制剂已成为近年来的研究热点之一。白杨素是一种主要存在于蜂胶、紫葳科和松科植物等食品和天然植物中的黄酮化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗高血压、抗糖尿病、抗高血脂等药理活性[5]，是新药研发中的一种非常重要的资源。研究表明，白杨素不仅可以显著改善大鼠血清蛋白水平，还能降低低密度脂蛋白胆固醇水平，而高胆固醇水平是动脉粥样硬化和许多与肥胖、心脏病、中风等脂质相关疾病的致病因素[6]。白杨素已成为治疗肥胖及其并发症等疾病的研究热点。

Mangal等[4]报道来源于木蝴蝶中白杨素对胰脂肪酶有一定的抑制活性，当其浓度为250 μg mL-1时，胰脂肪酶的抑制率为52.08%±2.14%，但其抑制机制尚不清楚。本研究运用多种光谱学方法并结合分子模拟技术，研究白杨素对胰脂肪酶的抑制作用及机制，以期为白杨素作为抗肥胖营养补充剂的深入研究提供理论参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；F-7000型荧光光度计(日本日立公司)；MOS 450型圆二色谱仪(法国Bio-Logic公司)；pHS-3C型pH酸度计(中国上海雷磁仪器有限公司)；Millipore Simplicity超纯水机(法国Millipore公司)。

PL(Ⅱ型，来自猪胰腺，100-400单位Mg-1蛋白)购自Sigma-Aldrich公司；奥利司他(纯度≥98%)购自(上海源叶生物科技有限公司)；白杨素(纯度≥98%)和对硝基苯丁酸酯(pNPB)来自阿拉丁(上海)有限公司。用Tris-HCl缓冲液(pH8.0,0.05 mol)配制PL和pNPB储备液，将白杨素溶于二甲基亚砜(DMSO)中作为储备溶液。由于DMSO有较强的极性，所以体系中DMSO的含量控制在5%(v/v)以下。

1.2 实验方法

1.2.1 酶活性测定

通过抑制动力学方法测定白杨素对PL的抑制能力。首先，用Tris-HCl缓冲液配制5 mg mL-1PL溶液，充分溶解后将PL溶液放置在离心速度为10,000×g的离心机上离心5 min后，得到的上清液作为PL储备液。在浓度为6.67×10-6mol L-1PL溶液中加入不同浓度的白杨素，混匀后置于37℃恒温水浴中孵育30 min，冷却至室温后，快速加入一定量的底物pNPB(最终浓度1.71×10-3mol L-1)启动反应，采用分光光度计的动力学/时间扫描模式在200 s内每间隔10 s测定1次反应体系在405 nm处的吸光度。通过关系式(1)，计算在含有不同浓度白杨素下PL的相对活性，并计算白杨素的半抑制浓度(IC50，表示PL活性被抑制50%时白杨素在反应体系中的浓度)[7]。未加抑制剂的PL活性定义为100%，奥利司他为阳性对照。

相对酶活性(%)=(R/R0)×100%

(1)

R0、R分别表示不存在抑制剂和添加不同浓度抑制剂时反应体系的吸光度随时间的变化率(均已扣除空白对照)。

1.2.2 抑制可逆性和抑制类型测定

采用上述相同的实验条件，在5组白杨素对PL活性抑制的测定体系中，固定pNPB浓度(最终浓度1.71×10-3mol L-1)，测定加入不同白杨素浓度时测定PL对pNPB的催化反应速率(ΔOD)，绘出ΔOD与PL浓度的关系曲线，根据该关系曲线分析白杨素对PL抑制可逆性。

在上述相同的条件下，在4组实验中，改变白杨素的浓度，同时保持PL最终浓度在6.67×10-6mol L-1，测定反应体系中不同浓度的pNPB对酶促反应速率的影响，根据Lineweaver-Burk双倒数方程，绘出酶促反应速率倒数与底物浓度倒数的关系曲线，评估白杨素对PL的抑制类型[8]。

1.2.3 荧光猝灭实验

分别准确移取0.1 mL的PL溶液和2.4 mL的Tris-HCl缓冲液于1 cm荧光比色皿中，反应体系中PL的浓度固定为2.67×10-6mol L-1，随后依次加入等体积的白杨素，共10次，每次滴加后混匀并静置5 min，测定反应体系在不同温度(298、304和310 K)下300～500 nm范围的荧光光谱，并扣除缓冲溶液的背景荧光。设置激发波长为280 nm，激发和发射狭缝宽度为2.5 nm。

同时配制上述相同的反应系列，在298 K下测定反应体系在Δλ=15和60 nm(Δλ=λem-λex)时200～400 nm范围的同步荧光光谱。为了消除“内滤光效应”，收集的荧光数据均通过以下方程进行校正[9]：

Fc=Fme(A1+A2)/2

(2)

Fc、Fm分别为校正后和测定的反应体系荧光强度，A1、A2分别表示白杨素在激发和发射波长下的吸光度。

1.2.4 非辐射能量转移

当PL的发射光谱和白杨素的吸收光谱有足够重叠时，它们的结合过程有可能发生非辐射能量转移。在相同条件下，以人血清白蛋白(HSA)为标准溶液(HSA荧光量子产率φst为0.13[10])，测量HSA和PL的荧光强度Fst和Fx及其激发和发射波长下HSA和PL的吸光度Ast和Ax，根据方程(3)计算PL的荧光量子产率(φx)[11]：

(3)

白杨素与PL之间的能量转移效率和结合距离可根据以下Förster非辐射能量转移理论方程求得[12]：

(4)

(5)

(6)

式中E代表PL与白杨素之间的能量转移效率，R0表示E=50%时的临界距离，κ2表示酶-抑制剂随机分布的取向因子，其值为2/3，N代表介质的折射率(1.336)，J为白杨素的吸收光谱与PL的荧光发射光谱之间的重叠光谱积分，ε(λ)和F(λ)分别表示白杨素在波长λ处的摩尔吸收系数和PL的荧光强度。

1.2.5 圆二色光谱测定

在反应体系中保持PL的浓度为1.0×10-5mol L-1，将不同浓度的白杨素加入反应体系中，充分混匀静止后，在连续氮气通入下，测定游离PL及白杨素与PL不同摩尔比时的圆二色光谱(190～250 nm)，扣除缓冲介质信号，所得数据运用在线SELCON3程序(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml)处理获得PL二级结构的含量[12]。

1.2.6 分子对接

应用Discovery Studio 4.5程序的CDOCKER算法进行白杨素、奥利司他、底物pNPB与PL的分子对接。白杨素、奥利司他、底物pNPB的3D结构文件选自PubChem网站，PL的晶体结构(PDB ID：1ETH)从RCSB：PDB蛋白质数据库获得[13]。对接前先除去PL晶体结构中的所有水分子，同时加入氢原子和加极性处理；通过软件中的CDOCKER程序执行受体PL和配体白杨素的对接，设定运行次数和对接公差分别设置为100和0.25。根据获得的对接结果，选择最低CDOCKER结合能的对接构象分析白杨素与PL的相互作用。

2 结果与讨论

2.2.1 白杨素对PL抑制作用

随着加入的白杨素浓度增大，PL的相对活性逐渐减小(图1A)，当白杨素的浓度达到1.01×10-3mol L-1时，PL的残留活性不再下降，随后基本达到稳定，表明白杨素能够抑制PL活性且存在浓度依赖关系。白杨素的IC50值为(8.21±0.02)×10-4mol L-1，而阳性对照奥利司他的IC50值则为(6.05±0.02)×10-5mol L-1，表明白杨素对PL有一定的抑制能力，但要弱于奥利司他。

(A)c(PL)=6.67×10-6 mol L-1,c(pNPB)=1.71×10-3 mol L-1;(B)c(pNPB)=1.71×10-3 mol L-1,c(chrysin)=0,1.80,3.60,5.40 and 7.20×10-4mol L-1 for curves a→e,respectively.

图1B为不同浓度白杨素存在下，酶促反应速率v与PL浓度的关系图。图中所有直线均通过原点，在相同浓度抑制剂存在下，PL的浓度与酶促反应速率v呈正相关，而反应体系中白杨素的浓度越大，直线斜率越低，表明白杨素对PL的抑制过程是可逆的，其主要通过形成分子间的非共价键而产生相互作用。

2.2.2 白杨素对PL的抑制类型

如图2所示，不同浓度下白杨素的拟合直线都在Y轴相交，同时直线斜率随着白杨素浓度增加而增大，而vmax保持不变，表明白杨素对PL的抑制为竞争型抑制[14]。对于竞争型抑制剂，可用以下动力学方程进行描述[9]：

(7)

(8)

观察到的每条直线的斜率与白杨素的浓度具有良好的线性关系(图2左上角插图)，表明白杨素与PL只有一个结合位点。根据方程(7)-(8)，计算出白杨素的抑制常数Ki值为(3.32±0.51)×10-4mol L-1，表明白杨素对PL具有中等强度的结合亲和力。

c(PL)=6.67×10-6 mol L-1,c(chrysin)=0,2.70,5.40 and 8.10×10-4mol L-1 for curves a→d,respectively.The upper left was a plot of slope vs.[chrysin].

2.2.3 白杨素对PL的荧光猝灭分析

图3A显示在激发波长为280 nm时，PL在345 nm处有最大荧光发射峰，而白杨素在此激发波长下的荧光强度很弱(曲线L)，几乎可以忽略不计。随着滴加白杨素浓度的增大，PL的荧光强度逐渐减小，表明白杨素与PL发生相互作用而猝灭PL内源荧光。

c(PL)=2.67×10-6 mol L-1,c(chrysin)=0,1.97,3.93,5.90,7.87,9.83,11.80,13.77,15.73,17.70 and 19.67×10-6 mol L-1for curves a→k,respectively.Curve L was the fluorescence spectrum of chrysin alone at the concentration of 19.67×10-6 mol L-1.

荧光猝灭根据猝灭机制不同分为静态猝灭和动态猝灭，静态猝灭是猝灭剂与荧光物质相互作用形成不发荧光的基态复合物而导致荧光猝灭，其猝灭常数与温度之间呈负相关，而动态猝灭则发生于猝灭剂与荧光物质的分子碰撞，其猝灭常数与温度呈正相关[15]。应用Stern-Volmer方程评估荧光猝灭机制：

(9)

其中F0和F分别表示白杨素加入前后PL的荧光强度，Ksv代表猝灭常数，[Q]是白杨素的浓度，Kq表示双分子猝灭速率常数，τ0表示未加入白杨素时荧光团分子的平均寿命，约为10-8s[9]。

根据Stern-Volmer方程，作F0/F与[Q]的关系图(图3B)，不同温度下(298、304和310 K)，F0/F对[Q]线性回归呈现出良好的线性关系(R>0.99)，表明白杨素对PL荧光猝灭为单一猝灭方式。通过方程(9)计算的猝灭常数Ksv值随温度升高呈降低的趋势(表1)，其相应的Kq(Ksv=Kqτ0)值也远大于生物分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数(2.0×1010L mol-1s-1)，表明白杨素对PL荧光猝灭机制为静态猝灭[16]。

表1 不同温度下白杨素与PL相互作用的结合参数及热力学参数

2.2.4 结合常数、结合位点数及热力学参数分析

静态猝灭过程中猝灭剂与荧光分子相互作用的结合常数(Ka)和结合位点数(n)通过以下方程计算[10]：

(10)

[Qt]和[Pt]分别代表白杨素和PL的浓度。计算出白杨素与PL的结合常数Ka值为104数量级L mol-1(表1)，表明其相互作用存在中等强度结合亲和力，Ka值随温度的升高而降低，表明温度升高两者结合作用减弱。3个温度下白杨素与PL的结合位点数n值都约为1，表明白杨素在PL上只有一个或一类结合位点，这与上述“2.2.2白杨素对PL的抑制类型”分析结果一致。

由热力学参数可以确定白杨素和PL之间的结合力的类型，焓变(ΔH°)、熵变(ΔS°)和吉布斯自由能(ΔG°)可由van’t Hoff方程求得[17]。

(10)

ΔG°=ΔH°-TΔS°

(11)

式中R值表示气体常数，其值为8.314 J mol-1K-1。由表1可见，白杨素与PL结合作用的ΔG°<0，表明两者结合是自发进行的；ΔH°<0，ΔS°>0，表明白杨素与PL相互作用过程是一个放热过程，疏水作用力和氢键是其结合的主要驱动力[18]。

2.2.5 同步光谱分析

Δλ=15和60 nm的同步荧光光谱分别为蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的特征光谱。图4A显示随着体系中白杨素浓度的增加，PL中酪氨酸和色氨酸残基的荧光强度逐渐降低，且2个荧光峰最大波长均有一定的红移(酪氨酸从286→291 nm，色氨酸从290→292 nm)，表明白杨素与PL的结合增强了酪氨酸和色氨酸周围微环境的极性[19]。同时，白杨素对同步荧光的猝灭百分率RSFQ(RSFQ=1-F/F0)结果表明，白杨素对色氨酸残基的荧光猝灭百分率稍大于酪氨酸残基(图4B)，当白杨素的浓度达到1.97×10-5mol L-1时，对色氨酸残基荧光猝灭百分率65.12%，而对酪氨酸残基荧光猝灭百分率62.35%，表明白杨素诱导PL的荧光猝灭，色氨酸残基的贡献稍大于酪氨酸残基，类似的结果在表没食子儿茶素与α-葡萄糖苷酶相互作用中也被发现[20]。

c(PL)=2.67×10-6 mol L-1,c(chrysin)=0,1.97,3.93,5.90,7.87,9.83,11.80,13.77,15.73,17.70 and 19.67×10-6 mol L-1for curves a→k,respectively.

2.2.6 非辐射能量转移和结合距离测定

图5显示白杨素的紫外-可见吸收光谱与PL的荧光发射光谱有一定的重叠。根据方程(3)计算出PL的荧光量子产率φx为0.12。再由上述方程(4)-(6)计算得到白杨素与PL之间的重叠光谱积分J=5.44×10-14cm3L mol-1，临界距离R0=3.26 nm，结合距离r=4.41 nm，r<8 nm 且0.5R0

c(PL)=c(chrysin)=2.67×10-6 mol L-1

2.2.7 圆二色谱分析

圆二色谱法是测定配体对蛋白质结构影响的一种灵敏有效的方法。如图6所示，游离PL的圆二色光谱在208和228 nm附近显示两个负的吸收峰，是PL结构α-螺旋的多肽骨架发生n→π*跃迁产生的特征峰[21]。随着加入白杨素浓度的增大，PL的2个峰信号强度逐渐降低，208 nm特征峰的位置也发生一定程度的红移，PL二级结构含量发生了变化(表2)。当白杨素与PL的摩尔比由0:1增大到4:1时，PL的α-螺旋由32.10%增加到34.37%，β-转角从23.97%提高到25.76%，而β-折叠则是从21.33%减少至19.84%，无规则卷曲从22.60%下降到20.03%，表明白杨素与PL相互作用导致PL的结构紧缩，其表面疏水性有所增加，将影响底物和PL的结合[22]。

c(PL)=1.00×10-5 mol L-1,the molar ratios([chrysin]/[PL])were 0:1,1:1 and 4:1

表2 白杨素对PL二级结构的影响

2.2.8 分子对接

分子对接技术可以直观地显示配体与受体的结合位点和结合构象并可用于其相互作用机理分析。图7A,C,E为白杨素、奥利司他和pNPB与PL进行100次分子对接结果中能量最低和结合次数最多的复合物结合构像。白杨素、奥利司他、pNPB结合于PL疏水空腔活性位点所需要的最低能量分别为-35.28、-54.78和-32.33 kJ mol-1，表明它们与PL的结合能力大小依次为奥利司他>白杨素>pNPB[23]。

图7 白杨素(A)、奥利司他(C)和pNPB(E)与PL分子模拟的3D结构图；白杨素(B)、奥利司他(D)及pNPB(F)相互作用的氨基酸残基

3 结论

本研究发现白杨素以竞争性方式可逆地抑制PL活性，其IC50值为(8.21±0.02)×10-4mol L-1，白杨素通过氢键和疏水作用与胰脂肪酶结合形成复合物，白杨素在胰脂肪酶上有一个结合位点且该位点更接近色氨酸残基，结合过程很可能发生了非辐射能量转移。白杨素主要与胰脂肪酶疏水空腔中Glu188,Pro194,Gln220、Thr221,Val322和Ser323残基发生氢键和疏水相互作用且占据了酶活性中心位点，导致胰脂肪酶的α-螺旋和β-转角含量增加，β-折叠和无规则卷曲含量减少，酶二级结构发生了变化，结构变得更加紧密，影响酶活性中心的形成，阻碍了底物进入活性中心与酶作用，从而降低了胰脂肪酶的催化活性。该发现为进一步研究白杨素作为天然抗肥胖的食品功能因子提供了理论参考。