Skp2/p27轴在结直肠癌发生发展中的作用机制研究

王海娟 郑雅宾 张静

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见肿瘤，死亡率位居各种肿瘤中第5位，5年生存率仅为50%，严重威胁人们的生命健康[1]。肿瘤的发生与癌基因的突变和抑癌基因的失活密切相关，上调p21、p27、p57基因表达，可增强结肠癌细胞凋亡并抑制细胞生长[2]。S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，Skp2)在多种人类癌症中过表达[3]，例如CRC组织[4]。Skp2过表达和p27的低表达与乳腺癌、黑色素瘤、鼻咽癌、前列腺癌和CRC的不良预后密切相关[5]。在CRC中，Skp2过表达可负向影响p27，p27在多种细胞中具有强大的生长抑制作用[6]。细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶调节亚基1(cyclin-dependentprotein kinase regulatory subunit 1，CKS1)基因的表达恶性肿瘤密切相关[7]。本研究通过干扰Skp2，观察其对CRC细胞LS513生长及迁移侵袭能力的影响。

对象与方法

一、对象

2020年9月～10月我院普外科切除的16例CRC组织及距离其边缘5 cm的癌旁组织，其中男9例，女7例，年龄40～62岁。术前均无肿瘤病史、放化疗及免疫治疗史。所有组织于离体5分钟内置于液氮罐中保存。人正常结肠上皮细胞CCD841CoN(ATCC CRL-1790TM)购自美国模式培养物集存库；人CRC细胞系LS513(目录号：TcHu237)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；人CRC细胞系SW480、HT29和SW620均由上海消化外科研究所赠与。本研究经医学伦理委员会批准和病人知情同意。

二、方法

1.主要试剂及仪器：BALB/c雌性裸鼠(4-6周龄，许可证号：SCXK(京)2016-0009)购于北京维通利华实验动物技术有限公司。含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM/F12培养基购自美国Giboc公司；CCK-8试剂盒购自MCE公司；RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；逆转录试剂盒购自美国Genecopoeia公司；pSUPER-siRNA NC(RNA干扰空载体)、pSUPER-siRNA Skp2(RNA干扰Skp2载体)均由上海生工生物有限公司构建；Skp2、p27和GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司合成；Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；Matrigel基质胶、PVDF膜、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)和GAPDH鼠抗均购自美国Sigma公司；ECL显色试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒均购自北京中山金桥生物科技有限公司；Skp2、p27、p21、p57、CKS1鼠抗和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗均购自美国Abcam公司；酶标仪Fax-20100购自美国INStat公司；尼康SMZ745光学显微镜购自于上海普赫生物科技有限公司；TL988 qRT-PCR仪购自西安天隆科技有限公司；全能型凝胶成像分析系统ChemiDoc-MP购自山东三瑞科技有限公司；转膜仪和电泳仪均购自美国Bio-Rad公司。

2.细胞培养：分别将各个细胞株接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，放于37 ℃,5% CO2培养箱中培养，当细胞培养至密度达80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞进行传代培养。

3.qRT-PCR检测Skp2和p27在CRC组织、癌旁组织及不同细胞系中的表达：使用RNA提取试剂盒分别提取CRC组织、癌旁组织以及不同细胞的总RNA，逆转录试剂盒逆转录得到cDNA，以cDNA为模板，按照qRT-PCR试剂盒说明书配置PCR反应体系：2×SYBR mix 10 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl，10×cDNA模板1 μl。反应条件设定为：95 ℃预变性5分钟、95 ℃变性15 s、60 ℃退火50 s、40个循环、72 ℃延伸10分钟。分别以GAPDH为内参，根据2-ΔΔCt算法，计算Skp2和p27 mRNA表达水平。Skp2、p27及GAPDH引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

4.细胞转染及分组：取生长密度达50%～60%的LS513细胞，使用Lipofectamine 2000转染试剂盒转染pSUPER-siRNA NC(siRNA NC组)、pSUPER-siRNA Skp2(siRNA Skp2组)，另取未转染LS513细胞(LS513组)作为对照，各组细胞转染或培养24小时后，检测各项指标。

5.CCK-8法检测各组细胞增殖活性：收集转染或培养24小时后的各组细胞，每孔100 μl接种至96孔板中，加入浓度为10%的CCK-8溶液，继续培养2小时后，于酶标仪上检测各孔在450 nm波长下的OD值，OD值越大表明细胞增殖活性越高。

6.Transwell小室法检测各组细胞迁移侵袭能力：取各组细胞，用不含FBS的DMEM/F12培养基，制成浓度为1×108个/ml的细胞悬液，取100 μl细胞悬液接种到Transwell小室上室，取600 μl含20% FBS的DMEM/F12培养基至Transwell小室下室，37 ℃培养24小时后，下室用4%多聚甲醛室温固定20分钟，PBS洗涤3次，甲醇固定15分钟，0.1%结晶紫室温染色40分钟。冲洗多余染液、晾干后，光学显微镜下观察并计数穿过微孔膜的细胞。检测侵袭能力时，需在Transwell小室上室铺50 μl普通Matrigel胶工作液(Matrigel胶∶培养基=1∶8)，并置于37 ℃恒温培养箱过夜，待Matrigel胶凝固后，其余步骤与细胞迁移能力检测实验相同。穿膜细胞数越多表明细胞迁移或侵袭能力越强。实验重复6次。

7.裸鼠成瘤实验检测各组细胞在动物体内成瘤能力：参考唐丹等[8]所用方法收集培养24小时后的各组细胞，使用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为2×106个/ml，取100 μl分别皮下接种于裸鼠右前肢腋下，观察肿瘤形成情况并于第20天时使裸鼠吸入过量乙醚后实施安乐死，仔细分离瘤体并称重。瘤体越重表明细胞成瘤能力越强。实验重复6次。

8.Western Blot法检测细胞中Skp2、p27、p21、p57、CKS1蛋白表达水平：收集置于液氮中的不同组织及培养24小时后的各组细胞，采用蛋白抽提试剂盒提取不同组织和细胞总蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，依次进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转PVDF膜、抗体封闭、1∶1 000浓度稀释后的p27、p21、p57、CKS1鼠抗4 ℃过夜孵育、TBST缓冲液洗膜，然后置于含辣根过氧化物酶缀合的二抗(1∶2 000)中室温孵育2小时、洗膜，用ECL试剂盒显色，全能型凝胶成像分析系统拍照，以GAPDH为内参，分析各组蛋白表达水平。

三、统计学分析

结果

1.Skp2和p27在CRC组织、癌旁组织和细胞系中的表达：与癌旁组织相比，CRC组织中Skp2 mRNA和蛋白表达水平显著升高，p27 mRNA和蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1和表2。与人正常结肠上皮细胞CCD841CoN相比，LS513、SW480、HT29和SW620癌细胞中Skp2 mRNA和蛋白表达水平显著升高，p27 mRNA和蛋白表达水平显著降低差异有统计学意义(P<0.05)。见表3和图1。其中，LS513癌细胞中Skp2表达水平最高，所以后续将选择LS513细胞进行RNA干扰载体转染实验。

注：A 癌旁组织；B CRC组织；C CCD841CoN正常结肠上皮细胞；D SW480癌细胞；E HT29癌细胞；F SW620癌细胞；G LS513癌细胞

表2 CRC组织和癌旁组织中Skp2和p27 mRNA和蛋白表达水平比较

表3 正常结肠上皮细胞细胞和癌细胞中Skp2和p27 mRNA和蛋白表达水平比较

2.干扰Skp2对LS513癌细胞增殖活性的影响：与LS513组比较，siRNA NC组细胞Skp2蛋白表达水平、细胞增殖活性比较差异无统计学意义(P>0.05)；与LS513组和siRNA NC组比较，siRNA Skp2组细胞Skp2蛋白表达水平和细胞增殖活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 干扰Skp2对LS513癌细胞增殖活性的影响

3.干扰Skp2对LS513癌细胞迁移侵袭能力的影响：与LS513组相比，siRNA NC组细胞迁移和侵袭能力差异无统计学意义(P>0.05)；与LS513组和siRNA NC组相比，siRNA Skp2组细胞迁移和侵袭能力显著降低(P<0.05)。见图2和表5。

图2 Transwell检测LS513癌细胞迁移侵袭图(结晶紫染色×200)

表5 干扰Skp2对LS513癌细胞迁移侵袭能力的影响

4.干扰Skp2对LS513癌细胞成瘤能力的影响：与LS513组比较，siRNA NC组细胞动物体内成瘤能力比较差异无统计学意义(P>0.05)；与LS513组和siRNA NC组比较，siRNA Skp2组细胞动物体内成瘤能力显著降低(P<0.05)。见表6。

表6 干扰Skp2对LS513癌细胞成瘤能力的影响

5.干扰Skp2对LS513癌细胞p27、p21、p57和CKS1蛋白表达水平的影响：与LS513组比较，siRNA NC组细胞p27、p21、p57和CKS1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；与LS513组和siRNA NC组相比，siRNA Skp2组细胞p27、p21、p57蛋白表达水平显著升高，CKS1蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3和表7。

图3 各组细胞中p27、p21、p57和CKS1蛋白Western Blot图

表7 干扰Skp2对p27、p21、p57和CKS1蛋白表达水平的影响

讨论

CRC是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈上升趋势，目前世界范围内发病率排名第3[9]。癌症的发生主要是由于癌基因和抑癌基因相互作用导致细胞周期调控失调所引起[10]。其中，Skp2基因是与细胞周期调控密切相关的基因，编码的蛋白质由436个氨基酸组成，分子量约47 kDa，Skp2通过对多种靶蛋白的泛素化降解而与细胞周期调控及肿瘤的发生、发展和预后密切相关[11]。Zhou等[12]研究发现，Skp2在CRC组织和细胞系中高表达，敲除Skp2在体外和体内均可降低CRC细胞的生长，且Skp2高表达与CRC预后差相关联。本研究发现，与癌旁组织和人正常结肠上皮细胞相比，CRC组织及LS513、SW480、HT29和SW620癌细胞中Skp2 mRNA和蛋白表达水平显著升高，p27 mRNA和蛋白表达水平显著降低，其中LS513癌细胞中Skp2表达水平最高，所以后续将选择LS513细胞进行RNA干扰。

Skp2在多种人类肿瘤中均过表达，具有潜在的致癌效应，调控多种细胞生物进程，包括细胞周期、生长、分化、增殖、转移和凋亡[13]。其中，Skp2的过表达可促进肝癌细胞HepG2的增殖，凋亡和侵袭，而siRNA Skp2可以降低HepG2细胞的增殖和侵袭，诱导细胞凋亡[14]，另外，Skp2抑制剂也可降低多发性骨髓瘤细胞的生存和增殖能力，诱导细胞凋亡[15]。RNA干扰(RNA interference，RNAi)能高效特异干涉目标靶基因的表达，产生类似基因敲除的效应。本研究采用siRNA Skp2处理后发现，与siRNA NC组相比，siRNA Skp2组细胞Skp2蛋白表达水平、细胞增殖活性、迁移侵袭能力及动物体内成瘤能力显著降低。Skp2在骨肉瘤细胞中主要发挥癌基因的作用，通过调控其信号通路中p21和p27的表达影响细胞生长、侵袭和迁移等恶性生物学行为[16]。提示Skp2在CRC细胞中也发挥癌基因作用，干扰Skp2可抑制CRC癌细胞的生长和迁移侵袭，但其中的机制尚需进一步研究。

Skp2参与p27、p21、p57等抑癌蛋白的降解，在细胞周期调控、细胞生长、分化、增殖、转移和凋亡等方面发挥重要作用[17]。精确地细胞周期调节是防止异常细胞增殖和癌症进展的关键，p21、p27和p57均为典型的细胞周期抑制蛋白，其过度降解可能导致癌细胞不受控制的增殖[18]，而CKS1基因控制细胞周期蛋白的丰度[19]，在肝癌组织中CKS1表达水平显著高于正常肝组织[20]。本研究发现，与siRNA NC组相比，siRNA Skp2组细胞p27、p21、p57蛋白表达水平显著升高，CKS1蛋白表达水平显著降低。Vasile等[21]研究发现，Skp2过表达可诱导p27蛋白连续降解，而蛋白水解和降解需要依赖CKS1为辅助因子[22]。提示干扰Skp2可能通过提高p27等抑癌蛋白表达水平，降低CKS1蛋白表达水平，抑制CRC癌细胞的生长和迁移侵袭，进而影响CRC发生和发展。

综上所述，Skp2/p27轴参与CRC发生发展，干扰Skp2可增高p27等抑癌蛋白表达，降低CKS1癌蛋白表达，抑制CRC细胞生长及迁移侵袭。推测靶向Skp2可能是一种潜在的CRC治疗策略。