小分子药物T-5224 对多种小鼠银屑病模型作用效果的研究

王丽，赵锐，张秋芳

1.淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博 255000；2.天津国际生物医药联合研究院，天津 300457

银屑病又名牛皮癣，该疾病是一种临床上比较常见的皮肤病，具有发病慢、病程久、易复发等特点［1］。临床表现主要为起初患者局部皮肤上出现少量的红色丘疹或斑丘疹，之后丘疹的分布范围逐渐扩大，甚至扩大到包括躯干、四肢、膝盖、头皮等全身各处皮肤［2］。

目前T-5224（见图1）正作为一种治疗类风湿性关节炎的药物在美国进入临床试验。该化合物是基于X-射线晶体结构并借助药效团3D 模型（见图2），设计合成出的c-fos/AP-1 的体内抑制剂［3］。该药物通过对c-Fos/AP-1 与DNA 结合活性的抑制，从而对基质金属蛋白酶（MMP）的活性产生影响并可有效降低机体内多种炎症因子的含量［4-6］。通过探讨T-5224 对胶原诱导的Ⅱ型关节炎小鼠模型及对体外滑膜细胞与软骨细胞的作用发现T-5224 可以有效降低血清、关节及细胞培养液中炎性细胞因子、基质金属蛋白的含量［7］；也能够降低急性肝损伤模型小鼠血清中肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-1β、白介素6（IL-6）的含量而促进抗炎细胞因子白介素10（IL-10）的释放［8］。有研究发现由于Cx31 蛋白缺失导致银屑病发生的分子机制［9］，而T-5224 可以通过选择性抑制c-Fos/c-Jun 信号通路而增加Cx31 蛋白的表达，可有效减轻银屑病的病症，而达到治疗该病的目的。

图1 T-5224 的化学结构式

图2 AP-1 小分子抑制剂的药效团3D模型

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康BALB/C 小鼠152 只，雌性，8～11 周龄，由北京军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号：NO.0006548。将小鼠饲养在屏障环境中，给予正常小鼠饲料与灭菌水饲养。

1.2 主要试剂及仪器

T-5224（由天津国际生物医药联合研究院药物合成组提供，纯度：98.9%）；丽科杰咪喹莫特乳膏（湖北科益药业股份有限公司，批号：120710）；医用白凡士林（南京特纳斯生物技术开发有限公司，批号：20180130）；阳性对照药物方希阿维A胶囊（重庆华邦制药有限公司，规格：10 mg/粒，生产批号：2018028）；己烯雌酚（广州市汉普医药有限公司，生产批号：121006，纯度＞99.2%）；小鼠TNF-α ELISA 检测试剂盒（柏卡生物有限公司，批号：20130201A）；小鼠白介素-10 ELISA 检测试剂盒（柏卡生物有限公司，批号：20130212A）。

全自动全封闭组织脱水机（型号：Leica ASP200S）；石蜡包埋机（型号：Leica EG1150H）；半自动轮转式切片机（型号：Leica RM2245）；半自动轮转式切片机（型号：Leica RM2245）；全自动染色机（型号：Leica Autostainer XL）；全自动玻片封片机（型号：Leica CV5030）。

1.3 咪喹莫特诱导小鼠银屑病模型的建立

将去毛后的小鼠根据体质量的不同进行随机分组，分为空白对照组、模型组、阳性对照药阿维A组、阴性对照组、实验药物T-5224（30 mg/kg）低剂量组、实验药物T-5224（300 mg/kg）高剂量组，共6 组，每组8 只。除空白对照组外，用玻璃棒将5%咪哇莫特乳膏涂抹于其他各组小鼠背部，涂抹剂量为62.5 mg，1 次/d，连续8 d。在建模的同时对各组实验小鼠进行分别给药，给药的方式为灌胃。空白对照组、模型组小鼠给予0.9%生理盐水；阴性对照组给予1%聚维酮（PVP30）溶液；阳性对照组给予阿维A 混悬液；T-5224 低、高剂量组分别给予T-5224（30 mg/kg）、T-5224（300 mg/kg）。给药的容积均为10 mL/kg 体质量，1 次/d，连续给药8 d。

1.4 小鼠皮损PASI 评分

银屑病样皮损面积和疾病严重程度（PASI）评分标准自提出以来一直作为评价某种药物对银屑病治疗效果的金标准被广泛应用［10］。各部分的评分标准如下：根据红斑由无到有，颜色由浅到深，斑块由大到小，得分为0～4 分；鳞屑从无到有、从小到大、从局部覆盖到全部覆盖，得分为0～4 分；根据斑块从无到有，从薄到厚，从微隆起到明显隆起，得分为0～4 分。根据皮肤受损部位的严重情况相应的打分。将以上各个指标的得分进行加权，得到最终的PASI 评分。写出PASI 总分算法。

1.5 小鼠血清中TNF-α、IL-10 含量的测定

通过小鼠眼眶后静脉采血方式，每只小鼠采血0.5 mL，使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后离心分离得血清。操作步骤分别按照小鼠TNF-α、IL-10 ELISA 检测试剂盒说明书进行，在450 nm 波长下测定各孔的OD 值。在Excel 工作表中，以标准浓度作横坐标，对应OD 值作纵坐标，绘制出标准曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

1.6 制作组织切片、HE 染色、小鼠皮肤组织学Baker 评分及表皮厚度测量

取材及固定：采用颈椎脱位的方法将小鼠处死，分别从上、中、下三个部位取其背部皮肤，大小约为1.5 cm×0.5 cm，并将剪取的组织立即置于10%的甲醛溶液中固定处理，固定的时间约24 h。制成石蜡切片利用中性树胶进行封片观察。

在400 倍视野下进行组织学观察，并拍摄图片。从每张组织切片中随机选取3 个较清晰视野作为Baker 组织学评分的目标。分别取每张切片的上、中、下三部分，每部分选择六个点测量表皮层的垂直厚度。

1.7 传统天然小鼠银屑病模型的建立

1.7.1 小鼠阴道上皮细胞有丝分裂增快模型 将实验小鼠随机分成空白对照组、模型组、阴性对照组、阳性对照药阿维A 组、实验药物T-5224 高剂量（30 mg/kg）组、T-5224 中剂量（10 mg/kg）组、T-5224低剂量（1 mg/kg）组，共7 组，每组8 只。空白组注射生理盐水除空白对照组外，其他各组小鼠进行腹腔注射己烯雌酚，剂量为0.2 mg/只，给药频率为1 次/d，给药时间连续3 d，使小鼠均处于动情期，3 d 后进行隔天注射，注射剂量不变，直到第12 天。除空白对照组外，其他各组小鼠从第4 天起分别进行灌胃给药，分别给予生理盐水、1%PVP 溶液、阿维A（10 mg/kg）、T-5224（30 mg/kg）、T-5224（10 mg/kg）、T-5224（1 mg/kg），给药容积10 mL/kg 体质量，1 次/d，连续8 d。在实验进行的第12 天，所有小鼠均采取腹腔注射的方式，注射秋水仙碱，剂量为2 mg/kg。6 h 后采用脱椎的方式，将所有小鼠处死，立即取出小鼠阴道组织，进行石蜡切片的制作。在光学显微镜下，计数有丝分裂指数。

1.7.2 计数小鼠尾鳞片表皮颗粒层 将实验小鼠随机分成空白对照组、阴性对照组、阳性对照药阿维A组及实验药物T-5224 高剂量（30 mg/kg）组、T-5224中剂量（10 mg/kg）组、T-5224 低剂量（1 mg/kg）组，共6 组，每组8 只。除空白对照组给予生理盐水外，其他各组小鼠采取灌胃给药的方式，分别给予1% PVP 溶液、阿维A（10 mg/kg）、T-5224（30 mg/kg）、T-5224（10 mg/kg）、T-5224（1 mg/kg），给药容积10 mL/kg 体质量，1 次/d，连续21 d。在第22天采用颈椎脱位方式将小鼠处死，取尾部皮肤，进行石蜡切片的制作，在光学显微镜下计数各组每只小鼠尾部表皮100 个鳞片中含有颗粒层的数量。

1.8 统计学方法

实验数据采用SPSS 20.0 统计软件进行分析，组间分析采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T-5224 对咪喹莫特诱导小鼠银屑病模型的影响

2.1.1 T-5224 有效抑制小鼠银屑病样炎症反应 与空白对照组相比，其他各组在涂抹咪喹莫特2 d 左右，小鼠皮肤均开始表现出鳞屑、红斑及增厚浸润。但阳性药物在给药的前3 d，均可有效控制皮损程度，将PASI 评分控制在较低的水平。但随着涂抹咪喹莫特建模时间的延长，阳性药物对皮损的抑制程度减弱。在建模的5～7 d 除空白对照组外的各组小鼠皮损表现最为严重，红斑面积增大、鳞屑增多、浸润程度严重，皮肤受损情况类似于银屑病病症。但是受试药物T-5224 低剂量组、高剂量组均可将PASI 皮损评分控制在较低的水平。与阴性对照组、溶剂组、甚至阳性药物组相比皮损症状较轻，皮肤相对较光滑、鳞屑较少、红斑及浸润程度也相对较轻，且T-5224 低剂量组皮损的治疗情况较高剂量组明显，见图3，图4。

图3 各组小鼠在建模并给药8 d后背部皮肤情况

图4 各组小鼠红斑、鳞片、皮损厚度及PASI评分情况

2.1.2 T-5224 对模型小鼠背部皮肤病理组织学影响 从病理学切片图可以看出，模型组与空白对照组相比表皮层增厚，透明细胞层与颗粒细胞比例增大，真皮炎细胞浸润，以淋巴细胞为主，汗腺萎缩，汗毛孔增大，局部可见炎性渗出，皮下毛细血管充血，脂肪细胞萎缩，表皮纤维瘢化。阴性对照组小鼠背部皮肤组织切片情况类似模型组；阳性药物组有炎性渗出物，角化程度略有减轻，透明细胞比例减少，颗粒细胞、基底细胞增多、增大且胞核变浅，表皮外层偶可见分裂相，汗毛孔基质细胞增生旺盛，汗腺异常，脂肪细胞萎缩同模型组，毛细血管充血情况有所改善，淋巴细胞的浸润程度较模型组要低。T-5224 低剂量组表皮层变薄，角化程度稍见好转，透明细胞数减少，基底细胞增殖程度下降，汗腺可见较明显的再生，脂肪层有所增厚，毛细血管浸润程度也明显减弱，仍存在少量淋巴细胞浸润现象；T-5224 高剂量组，表皮略呈现剥落坏死，脂肪层严重萎缩，皮下纤维组织可见坏死症，未见基底细胞增殖，也可见毛细血管充血，见图5。通过小鼠皮肤组织学Baker 评分统计30 mg/kg T-5224 组小鼠模型组小鼠相比差异有统计学意义，见表1。病理切片结果可部分反应，低剂量的T-5224 具有抑制上皮细胞角化、抗炎、促使表皮及真皮层组织结构正常化等特点，但药物过量可能会引起全身系统反应。

图5 各组小鼠背部皮肤组织切片（HE×400）

2.1.3 T-5224 对模型小鼠血清中TNF-α、IL-10 含量的影响 研究发现通过涂抹咪喹莫特诱导建模后，模型组小鼠血清中TNF-α 的含量明显较空白对照组升高，低剂量（30 mg/kg）、高剂量（300 mg/kg）及阳性药物阿维A 均可有效降低银屑病模型小鼠血清中TNF-α 的含量，同时均可有效升高银屑病模型小鼠血清中IL-10 的含量（P＜0.05），见表1。

表1 Baker 评分及小鼠血清中TNF-α和IL-10的浓度（）

表1 Baker 评分及小鼠血清中TNF-α和IL-10的浓度（）

注：与模型组比较，aP＜0.05。

2.2 T-5224 对传统小鼠银屑病模型的影响

2.2.1 T-5224 对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响通过不同浓度的T-5224 对雌激素刺激下的小鼠阴道上皮细胞有丝分裂抑制情况的研究发现，低剂量（1 mg/kg）的T-5224 对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的抑制情况差异无统计学意义。当T-5224 浓度达到10 mg/kg 时，则对有丝分裂指数产生较明显影响，当T-5224 浓度达到30 mg/kg 时，对有丝分裂指数的影响最明显，且与中剂量组相比差异有统计学意义，而与阳性药物组相比差异无统计学意义，说明T-5224 的给药浓度达到30 mg/kg 时，对细胞的过度增殖抑制作用最强，可有效针对银屑病角质细胞过度增殖这一特点，见图6，表2。2.2.2 T-5224 对小鼠尾鳞片颗粒层细胞形成数的影响 给予不同药物21 d 后，通过对各组小鼠尾鳞片颗粒层细胞形成数的分析发现，空白对照组及阴性对照组小鼠尾鳞片颗粒层细胞数均较少，且两组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。阳性对照药物组，T-5224 低、中、高剂量组颗粒层细胞数均呈现不同程度的增加，且与空白对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。统计结果表明阳性药物组颗粒层细胞数目最多（图7，表2）。随着T-5224 浓度的升高促进作用逐渐增强；当T-5224 达到较高剂量（30 mg/kg）时，其促进作用与阳性药物相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图6 各组小鼠阴道组织切片（HE×1000）

图7 各组小鼠尾部皮肤组织切片（HE×1000）

表2 各组小鼠阴道上皮细胞有丝分裂指数及尾鳞片颗粒层形成数（）

表2 各组小鼠阴道上皮细胞有丝分裂指数及尾鳞片颗粒层形成数（）

注：与模型组比较，aP＜0.05；与空白对照组比较，bP＜0.05。

3 讨论

由于银屑病只可在人类与灵长类动物中自发形成，所以缺少银屑病相关模型，从而阻碍了对该病发病机制与治疗的研究进展［11］。在选择合适的受试动物的基础上，成功建立银屑病模型，是研究银屑病机制与治疗的关键。虽然小鼠皮肤与人的皮肤存在一定的差异，如小鼠表皮厚度较薄、皮肤毛囊数量较多、真皮较薄，不利于瘢痕的形成等［12］。但是，近些年研究发现，利用小鼠作为受试动物建立的银屑病模型可以较准确而全面地反映银屑病的发病特征。本研究选用了咪喹莫特乳膏诱导的银屑病样小鼠模型与传统天然模型相结合的方式探讨了T-5224 对银屑病的治疗作用和量效关系，为T-5224用于银屑病的治疗提供了理论基础。将来可以运用免疫组化、细胞培养等技术并结合部分生化指标及多种银屑病相关细胞因子的检测［13-15］，使该研究进一步深化。