外泌体MicroRNA在部分肺部疾病中的研究进展

贺艳飞 郭小旭 姚培学 欧阳瑶

外泌体(Exosomes)是由细胞产生的具有生物活性的纳米级载体，普遍存在于大多数体液中。外泌体中富含的微小RNA(microRNA，miRNA)称为外泌体miRNA，它是一种多功能非编码RNA，对基因调节至关重要。外泌体miRNA在细胞间物质和信号转递中至关重要，参与炎症、细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学过程，从而可能调节多种病理过程。外泌体已被视为当前研究的热点。最近的研究发现，外泌体miRNA在肺部疾病的发病机理中具有重要意义。本文旨在综述有关外泌体miRNA在慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)、哮喘、特发性肺纤维化(IPF)和肺结核等常见肺部疾病中的研究进展。

外泌体MicroRNA的概述及生物学特性

一、外泌体的概述

外泌体由晚期内体即多囊泡体(multivesicular body，MVB)产生的直径在30～150 nm的具有双层脂质膜的载体[1]。外泌体由大部分细胞分泌，普遍分布于血浆、血清、痰液和母乳等体液中[2]，其表面表达CD63、CD81、CD9等标记蛋白。其可调节炎症和免疫反应，也参与肿瘤的发病机理中[3]。也有报道，其在组织再生、靶向治疗、人工外泌体模拟或作为生物标记物中的潜力[4]。在呼吸系统疾病方面也取得了类似的进展。研究表明，外泌体在肺癌、慢阻肺、哮喘、肺结核和间质性肺病等肺部疾病的发生发展中起着重要作用[5]。越来越多研究发现，可以从支气管肺泡灌洗液(BALF)、唾液和痰等生物液中分离外泌体[6]。体液中外泌体含量的稳定性归因于其双层膜结构，并保护了它们作为潜在的生物标记物。外泌体已被作为诊断肿瘤等疾病的生物标记物及治疗工具[7]。但在肺部疾病中，外泌体的研究正处于初始阶段。Prado等[8]报道，哮喘小鼠的BALF衍生外泌体的给药、抑制了IgE反应和气道炎症。因此，外泌体可能是治疗过敏性疾病的候选方式。另一种有望的诊疗策略是利用外泌体进行气道炎症治疗，即利用人间充质干细胞(MSC)分泌的外泌体。

在实验小鼠中，人MSC释放的外泌体系统给药可改善嗜酸性和中性粒细胞气道过敏性反应[9]。MSC衍生外泌体通过增加外周血中IL-10和TGFβ1表达而具有抗炎作用[10]。目前正在研究，以确定在哮喘或慢阻肺患者中使用MSC的疗效性和安全性。利用外泌体进行药物传递具有一定的优势，低免疫原性和毒性的人工外泌体，可以传递如miRNA等生物成分给靶细胞。

二、外泌体MicroRNA的概述

miRNA是一种由内源性基因编码的18～22个核苷酸序列构成的多功能非编码RNA，作用于靶mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)在转录后水平上调控基因表达[11]。miRNA是基因表达网络中的关键调节因子，可诱导细胞增殖、死亡、激活细胞迁移、增强免疫反应和诱导血管生成等。细胞内异常的miRNA可导致遗传物质的传递受损。miRNA作为肿瘤、糖尿病和脂质紊乱等多种疾病潜在的无创生物标志物[12]。miRNA表达谱，有望作为多种疾病有前景的生物标志物，miRNA的检测可以使用miRNA微阵列、面板型miRNA QPCR板等各种技术[13]。

外泌体包括miRNA、蛋白质、信使RNA(mRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)及脂质等信号物质，经自分泌和旁分泌靶向作用于邻近或远端细胞，进行细胞之间的信息交换从而调节细胞的生物学功能，在细胞动态平衡和调节生物行为过程中至关重要[14]。其中富含的miRNA称为外泌体miRNA。近年报道集中在外泌体miRNA的功能上。Valadi等[15]报道，外泌体含有miRNA的存在，外泌体的脂质双层膜结构使miRNA免受体液中的酶溶解而维持其稳定性，还可携带并递送miRNA至靶细胞进而影响细胞的生物行为和病理生理的发展，其参与炎症、细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学过程，从而可能调节多种病理过程。外泌体中包括多种RNA，但富含miRNA，其占总RNA的76.2%，以miRNA为主要生物活性物质，外泌体中的miRNA的数量和类型不是随机分配的，而是由细胞选择性的分为外泌体内含物。研究发现，外泌体miRNA在慢阻肺、哮喘、IPF等呼吸系统疾病的发病机制中具有重要意义[16]，且它们具有非免疫原性和快速提取的特点，因此，外泌体miRNA有希望作为肺部疾病的一种新的诊断和治疗的生物标志物。

外泌体MicroRNA与慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺病( Chronic Obstructive Pulmonary Disease，简称慢阻肺)是以气道慢性炎症引起的气流受限为特点的慢性疾病。支气管和肺泡上皮细胞作为宿主免疫防御的第一线构成部分，当受到刺激时，可分泌含有特定miRNA的外泌体分泌到细胞外环境中，通过激活静止干细胞和上皮细胞、并恢复其细胞周期从而促进上皮损伤的修复[17]。此外，受到损伤细胞分泌的外泌体miRNA通过引发一系列炎症反应清除有害应激原及促进组织修复来维持局部微环境的动态平衡，从而参与慢阻肺的发生发展[18]。据报道，吸烟者和非吸烟者的BALF中外泌体miRNA 的表达存在差异。Ezzie等[19]对比了健康吸烟者和慢阻肺患者的肺内外泌体miRNA水平，在慢阻肺患者的肺中主要观察到miR-223和miR-1274a的表达增加，提示外泌体miRNA在慢阻肺和非慢阻肺的吸烟者的肺中水平不同，另一项研究侧重于特定的外泌体miRNA在慢阻肺发生发展中的作用，Conickx等[20]报道，与非吸烟者比较，无气流限制的吸烟者和慢阻肺患者肺中的miR- 218-5p水平显著降低；香烟烟雾诱导的小鼠和人支气管上皮细胞(HBE)中的miR-218-5p的表达也减少，重要的是，miR-218-5p的表达与气道阻塞密切相关。此外，miR-218-5p在人和鼠肺中的细胞定位显示BE中miR-218-5p的最高表达。用miR-218-5p模拟物或抑制剂进行的动物实验表明，miR-218-5p对香烟烟雾引起的气道炎症有保护作用[20]。BE与成纤维细胞的异常通讯对于气道重塑至关重要，最近报道，外泌体miRNA通过调节上皮-间充质转化(EMT)可促进慢阻肺的发展。Xu等[21]报道，香烟烟雾可以修饰外泌体miRNA，香烟烟雾刺激的HBE分泌的外泌体miR-21水平高于对照组，且HBE衍生的外泌体miR-21可作为成纤维细胞分化的介质；在慢阻肺小鼠模型中，miR-21的表达减少减轻了烟雾刺激的气道重塑，吸烟者和慢阻肺患者的血清中miR-21表达显著升高，与FEV1/FVC呈负相关[21]。Fujita等[22]研究表明，外泌体miR-210可能经自噬途径参与肌成纤维细胞转化。研究发现，慢阻肺和健康吸烟者的BALF中包括miR-338-3p、miR-204-5p 和 miR-618等23种外泌体miRNA的水平发生变化。这些差异表达的外泌体 miRNA 与TNFα、NF-κβ 和 MAPK 信号传导等相关[23]，表明它们对慢阻肺中持续的炎症反应有影响。因此，外泌体miRNA有望作为慢阻肺诊断和治疗的手段。

外泌体MicroRNA与支气管哮喘

支气管哮喘(bronchial asthma，哮喘)是气道受到非特异性刺激引起的一类气道炎性疾病，多种细胞如嗜酸性粒细胞等参与发病。气道高反应性(AHR)、气道炎症和气道重塑是其发病机理的主要因素[24]。证据表明，哮喘相关细胞(如嗜酸性粒细胞)释放的外泌体miRNA可以充当细胞间信息交换的介质，从而促进气道炎症、AHR和气道重塑的发展。据报道，与健康人相比，哮喘患者的嗜酸性粒细胞中的MVB可释放更多外泌体miRNA[25]。另一项报道，哮喘患者的嗜酸性细胞来源的外泌体miRNA可促进小气道上皮细胞的凋亡和支气管平滑肌细胞的增生，这是造成气道重塑的重要因素[26]。在某些情况下，尽管相同的外泌体miRNA可能在组织中减少，但气道相关体液中的外泌体miRNA增加。在家尘螨(HDM)刺激的哮喘小鼠模型中，与空白组比较，模型组的BALF中外泌体miRNA明显升高。这些外泌体miRNA上调了31个基因的表达，包括IL-13和IL-5Ra，它们分别是miR-346和miR-574-5p的推测靶点[14]。因此，当特定的miRNA被外泌体携带并传递时，细胞内基因被积极调控。Maes等[27]报道，与健康受试者相比，重度哮喘患者痰中三种外泌体miRNA(miR-629-3p，miR-223-3p 和 miR-142-3p)水平升高，miR-223-3p和miR-142-3p的表达与气道阻塞(FEV1 / FVC)相关。HBE中 miR-629-3p 的上调诱导了促炎细胞因子IL-8的表达，表明该外泌体miRNA可能与嗜中性哮喘的炎症表型有关。Collison等[28]报道，在哮喘小鼠模型中，发现miR145参与气道平滑肌细胞的增殖和上皮细胞炎症的发生；抑制miR-145表达时可减轻嗜酸性炎症、粘液高分泌和AHR。因此，外泌体miRNA在哮喘的发病机制中具有重要意义，进一步研究有望将外泌体miRNA作为生物标记物候选物，可以鉴别哮喘及其类型，从而提高未来诊断和治疗的有效性。

外泌体MicroRNA与特发性肺纤维化

特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)是一种不可逆的、渐进性的、原因不清的肺部疾病，可在诊断后2～3年内导致死亡，IPF的特征是由纤维化“瘢痕”形成引起肺结构进行性和不可逆转的破坏，最终导致器官破坏和呼吸衰竭而死亡[29]。在环境压力的影响下，源自肺免疫细胞的外泌体的数量会急剧增加，其组成也会发生变化(如miRNA)。几项研究表明，这些改变的外泌体miRNA与炎症和纤维化相关的肺部疾病的进展有关。Yao等[30]发现，在IPF大鼠模型中，M2巨噬细胞来源的外泌体过表达 miR-328可促使肺间质成纤维细胞的增殖，并通过调节家族序列相似性13成员A(FAM13A)基因而促进肺纤维化的进展。Njock等[6]已发现3个miRNA(miR-142-3p，miR-33a-5p，let-7d-5p)在IPF患者的痰源性外泌体中与健康受试者相比异常表达。有趣的是，miR-142-3p与单位肺泡容积的弥散量(DLCO/VA)呈负相关，这表明痰中的外泌体miRNA与肺纤维化的程度有关。外泌体miR-29c具有保持上皮完整性，促进损伤的修复，并减少纤维化的作用，动物实验表明，与健康小鼠相比，IPF小鼠模型中II型肺泡上皮细胞中的外泌体miR-29c减少[31]。因此，外泌体中包括有益的 miRNA(如 miR-29c)可能是针对IPF的新型靶向治疗模式。外泌体miRNA有希望作为IPF诊断、治疗和严重程度评估的生物标记物。

外泌体MicroRNA与肺结核

肺结核(Pulmonary Tuberculosis，PTB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的呼吸系统感染且具有传染性的疾病。如果不被宿主的免疫防御系统清除，感染人体的Mtb会在宿主细胞(尤其是巨噬细胞)中存活[32]。因此，Mtb与宿主免疫细胞(如巨噬细胞)之间的相互作用可能会影响结核病(TB)的发生与发展。感染了Mtb 的巨噬细胞可以将特定外泌体miRNA释放到细胞外。研究证明，被牛分枝杆菌卡介苗感染的单核细胞衍生巨噬细胞能够释放特定的外泌体miRNA，包括 miR-1224、miR-1293、miR-425、miR- 4467、miR-4732、miR-484、miR-5094、miR-6848、miR- 6849、miR-4488 和 miR-96[33]。Alipoor等[34]从11种表达量最高的外泌体 miRNA 中选择3种外泌体miRNA(miR-484/miR-425 和 miR-96)作为诊断生物标志物，以评估其对PTB的诊断价值。ROC曲线分析表明，血清外泌体 miR-484、miR-425和miR-96的AUC值分别为 0.72、0.66和0.62，并且通过涂片阳性程度发现三种血清外泌体miRNA与结核感染的程度密切相关。考虑到这些表达不同的外泌体miRNA可能成为肺结核诊断的生物标记物，需进一步的研究以阐明这些外泌体miRNA参与肺结核的发病机制，从而开发诊断和治疗该病的新靶点。

展 望

外泌体miRNA介导细胞间通讯，成为研究热点，越来越多的研究表明外泌体miRNA在肺部疾病(如慢阻肺、哮喘、IPF和肺结核)中的表达异常，在其发病机理中具有重要意义。本文主要阐述了外泌体miRNA在肺部疾病的发生发展中的作用。探讨了其作为生物标志物的潜力，可能在临床上用作诊断和管理肺部疾病的生物标志物及治疗手段。对慢阻肺、哮喘、IPF和肺结核等肺部疾病中的外泌体miRNA的研究尚处于起步阶段，需要进一步的研究外泌体miRNA介导肺部疾病的发病机理，并揭示它们在疾病进展中扮演的角色。未来关于外泌体miRNA对呼吸系统疾病的发病机制的贡献的研究将为其在该领域的临床应用提供前景。