原代藏獒细胞培养与生物学特性研究

刘文凯，田 玲，乔自林，李 铀，王家敏，王明明

（1.西北民族大学 生物医学研究中心甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生命科学工程学院，甘肃 兰州 730030）

各国特有的物种基因资源，早就成为世界关注和争夺的焦点，许多国家己经将基因资源库的建设列为未来社会可持续发展以及打赢未来经济战的战略建设工程。藏獒原产于青藏高原，分布于海拔3 000～5 000 km的严寒地带，属于国家二级保护动物[1]。极端恶劣的生活环境造就了藏獒特殊的身体构造和生理特性[2]。这是藏獒可以在恶劣生存环境中维持协调统一性状并匹配环境多样性的主要原因[3]。目前，对藏獒的研究多集中于培育养殖、品种鉴定等方面，细胞、分子水平的研究相对较少[4]。

近年来，为了了解细胞增殖与衰老的分子机制，为治疗肿瘤、控制肿瘤细胞增殖以及器官移植等奠定基础，或使传代困难、增殖慢、易衰老的细胞获得永生，获得更多的细胞资源，细胞永生化研究成为热点。细胞永生化（cell immortalization）指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离, 从而具有无限增殖能力的过程。通过基因转染等技术将外源性永生化基因，如病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等，导入目的细胞内, 以增加永生化的发生率, 进而建立永生化细胞株（immortalized cell strains），以达到使体外培养的细胞具有无限增殖能力且细胞间无差异的目的[5]。

染色体的数目与核型是细胞稳定传代的关键，是能够用来鉴别细胞种类特征的关键标准[6]。病毒介导方式的永生化可能会使细胞的染色体数目发生缺失或增加。因此，对细胞进行染色体分析也是确定其稳定传代的因素之一。

该研究利用实验室前期自主分离的藏獒肾脏细胞，探讨了其体外培养的形态特征、传代次数、冻存复苏、生长特性、细胞核型以及G418最低致死浓度，为藏獒肾脏细胞永生化的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021年2—6月在西北民族大学生物工程细胞中心实验室进行。以实验室前期自主分离的藏獒肾脏细胞为材料，采用10%胎牛血清配置的细胞培养液在T25细胞培养瓶中进行培养。

1.2 试验方法

1.2.1 原代细胞传代按照细胞生长情况及时更换新鲜细胞培养液进行传代培养，等细胞生长密度达85%～90%以上时按照1∶3的比例进行传代培养，适时观察拍照，并记录细胞生长状态，着重记录F2、F5、F10代细胞状态。

1.2.2 细胞冻存与复苏把冻存管放在37℃的水浴中快速摇动，在90 s内摇动至融化，混匀离心后放入T25细胞培养瓶加入新鲜培养基，24 h后更换新鲜培养液，至细胞生长密度达到85%～90%时，加入胰酶进行消化，然后离心保留细胞，加入细胞冻存液，按照4℃10 min、-20℃30 min、-80℃过夜、液氮永久保存的顺序缓慢冻存。

1.2.3 细胞生长特性观察将F3代、F5代、F10代细胞分别接种至六孔板中，待生长密度达70%～80%时，在倒置显微镜下观察细胞形态特征，对比细胞传代前后的差异，并拍照记录。

1.2.4 复苏细胞活率测定取3只冻存后的F4代细胞，用台盼蓝染色法，将待检细胞复苏后制成细胞悬液，按1∶1比例混匀，加入细胞计数板中，活细胞细胞结构完整，透明无色，死细胞均为蓝色。每只冻存管计数3次，加入细胞计数板后，利用细胞计数仪计算活率，即为细胞活力。

1.2.5 细胞生长曲线绘制取2瓶生长密度至85%的F3代细胞按照1×104个/孔加入24孔细胞培养板孔中，每日更换培养液，进行细胞计数，取3个平行样的均值，以培养时间作为横坐标，以细胞密度作为纵坐标，利用prism软件，绘制细胞生长曲线。

1.2.6 G418最低致死浓度筛选取生长状态良好F3代细胞，在24孔培养板中按照1×104个/孔的标准，当细胞铺展率约为50%～60%时加入含有不同浓度G418的筛选培养基，G418浓度区间为0～1 000 μg/mL，以100 μg/mL为一个梯度配置11个不同的筛选浓度。每2 d更换筛选培养基，显微镜下观察并记录细胞生长状况，第14天能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最低致死浓度。

1.2.7 核型分析将形态与生长状态良好的F3代细胞接种至6孔培养板，加入秋水仙素溶液处理6 h；经过胰酶消化后，加入预热的氯化钾吹打，置于37℃培养箱静置30 min；弃去氯化钾，加入固定液，1 500 r/min离心5 min；反复3次后吸取重悬液从50 cm高处滴至玻片上，立刻在酒精灯上过3～5个来回，风干30 min；用10%的Giemsa染液染色20 min后，在蒸馏水下进行冲洗，之后在倒置显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 形态学观察

通过传代培养，每代细胞按照1∶3比例进行传代，保证每代细胞最少有5瓶，并对生长良好的F2、F3、F5、F8代细胞进行冻存。观察发现，细胞形态均为成纤维细胞，形状梭形（图1），呈放射状与旋涡状样式生长，经过复苏后形态与长势均呈现良好状态。观察还发现，F1代至F5代，细胞增殖较快，呈放射状生长，细胞呈梭形，长势良好；F5代至F8代，细胞增殖减弱甚至停滞，细胞呈多边形状态，出现细胞脱落现象，最终于F8代无法继续生长。

图1 F3、F5、F8代藏獒肾脏细胞的生长状态比较

2.2 复苏细胞活率测定

藏獒细胞冻存前平均活力为 97%，冻存2个月后取3支细胞进行复苏，测出的平均活力为 91%。

2.3 细胞生长曲线绘制

如图2所示，藏獒组织细胞生长状况较好，生长曲线呈“S”型，细胞生长均符合体外细胞生长规律。按照细胞群体倍增时间的公式：PDT=t×lg2/(lgNtlgN0)。其中，t表示培养时间，N0表示第一次所得的细胞数目，Nt代表示培养t时间后的细胞数目。由此可得细胞的倍增时间为27 h。

图2 F3代藏獒肾脏细胞的生长曲线

2.4 G418最低致死浓度筛选

为了后续永生化试验阳性细胞的筛选，在培养液中分别添加0～1 000 μg/mL的G418， 每100 μg设置1个梯度，培养F3代藏獒肾脏细胞14 d，结果表明，500 μg/mL浓度组及更大浓度组的细胞在第14 天全部死亡，表明500 μg/mL可作为G418筛选藏獒肾脏细胞的最低致死浓度（图3）。

图3 不同浓度的G418处理对F3代藏獒肾脏细胞的影响

2.5 核型分析

由图4可知，正常的藏獒肾脏细胞染色体数目为2n=78，包括38对常染色体和1对性染色体。

图4 正常藏獒肾脏细胞的染色体

3 讨 论

犬这个物种的起源一直是生物界关注的热点，经过多方论证，目前学界已有共同认知，即：所有家犬均来自于灰狼[7]。目前，有对牧羊犬、阿拉斯加等犬的细胞进行体外培养，但藏獒细胞体外培养相关案例较少[8]。动物体细胞的体外培养会受到许多因素的影响，如培养环境、培养方法等。细胞的染色体改变也会对增殖能力产生巨大影响[9]。细胞生长曲线能够较好地展示细胞数目的改变，在细胞生长过程中也可通过糖耗来反映细胞的活力，从而明确细胞的状态[10]。

该研究表明，藏獒肾脏细胞体外培养时形态均为成纤维细胞，形状梭形，呈放射状与旋涡状样式生长，经过复苏后形态与长势均呈现良好状态；F1代至F5代，细胞增殖较快，呈放射状生长，细胞呈梭形，长势良好；F5代至F8代，细胞增殖减弱甚至停滞，细胞呈多边形状态，出现细胞脱落现象，最终于F8代无法继续生长；生长曲线测定结果显示，24孔板内细胞数目最高值达到4.06×105个/mL，最短倍增时间为27 h，说明细胞生长速度较快。

动物体细胞在体外培养的条件下，随着传代数目的增多，染色体数目可能发生变化[11]。体细胞染色体的倍增数目与动物细胞的培养方式有关[12]。藏獒成纤维细胞的染色体研究，对藏獒的分类和繁衍有重大参考价值。根据图像软件排序，可展示藏獒细胞染色体的数目和形态特征[13]。但是，藏獒细胞染色体的玻片标本还具有无法轻易看出的染色体，目前在技术上还存在一些难点，无法进行深入研究，后续可通过荧光探针等方法进行深入探索[14]。

G418是一种糖类抗生素，与卡那霉素、氨苄霉素的构造相近，可通过对80S核糖体的调控而阻止蛋白质的生成，对细胞具有毒性，是筛选稳定细胞系最常用的试剂[15]。带有neo基因的细胞通过转染具有免疫后，能够抵抗带有G418的筛选培养基[16]。目前，G418的这种功能在基因敲除、基因过表达等领域有较高的应用价值[17]。结果显示，500 μg/mL及以上浓度的G418处理组，藏獒细胞在培养第14天即全部死亡，表明500 μg/mL可作为G418筛选藏獒肾脏细胞的最低致死浓度。

实验室前期采用组织块法构建了藏獒肾脏组织细胞系，细胞冻存代次均在3代以内，形态较好。复苏后细胞活力均保持在90%以上。该研究利用实验室前期自主分离的藏獒肾脏细胞，探讨了其体外培养的形态特征、传代次数、冻存复苏、生长特性、细胞核型以及G418最低致死浓度，明确了藏獒肾脏细胞自发传代的最终代次，发现了自发传代中存在的问题，为后续的病毒感染筛选打下了基础，同时也为进一步研究藏獒细胞的生物学特性奠定了基础。