甜玉米维生素C 含量的QTL 定位

蒋 锋，闫 艳，罗智佳，陈青春，张姿丽，刘鹏飞

（1.仲恺农业工程学院农业与生物学院，广东 广州 510225；2.广州市特色作物种质资源研究与利用重点实验室，广东 广州 510225）

【研究意义】维生素C 是人体必需的微量物质，在人体生命活动方面起着重要作用。维生素C 可以增强人体免疫力、预防人体动脉硬化、参与人体胶原蛋白合成［1］，对缺乏维生素C 而引起的各种疾病（如坏血病、贫血等）有显著的治疗效果，而且还可以预防癌症等重大疾病［2］。同时，维生素C 的摄入可以提高人体对铁和锌的吸收利用率，降低这两种主要微量营养素缺乏的风险［3］。在人体内，维生素C 有两个重要功能：一是在多种酶促反应中作为辅助因子；二是作为抗氧化剂保护细胞免受ROS的毒害和自由基介导的损伤［4］。而人体无法产生合成维生素C 的酶，要从合成药物或者食物中获取日常必需的维生素C［5］。由于人工合成的维生素C 在吸收效果和功效等方面均不及天然维生素C，并且长期服用化学合成的维生素C 可能会有副作用，消费者对天然维生素C 的需求日益增加［6］。准确定位甜玉米维生素C含量的QTL，找到与之紧密连锁的分子标记，对挖掘利用高维生素C 含量甜玉米种质资源具有重要意义。

【前人研究进展】1998 年，Glen 等［7］揭示了第一条维生素C 合成途径，此后有科学家利用该合成途径通过转基因技术对作物进行遗传修饰，来提高水果和蔬菜中维生素C含量。Zhang等［8］使GME基因（编码催化L-半乳糖途径的酶的基因）在番茄中过量表达，使番茄果实和叶片维生素C 的含量增加1.19～1.60 倍；Sean 等［9］使GGP基因（编码催化L-半乳糖途径的酶的基因）在番茄、草莓、马铃薯中稳定过量表达，将果实和块茎的维生素C 含量增加2～6 倍；Hemavathi 等［10］在马铃薯中异位表达来自草莓的Ga1UR基因（D-半乳糖醛酸途径相关的基因），使马铃薯块茎的维生素C 含量增加2～3 倍；Jain 等［11］在莴苣中异位表达大鼠-L 古洛内酯氧化酶（一种参与动物体内维生素C 合成的基因），使莴苣中维生素C 含量增加约7 倍。利用分子标记生成连锁图谱对维生素C 含量相关基因进行QTL 定位，可以检索到与维生素C 含量相关的基因组区域，增加对植物维生素C 含量相关基因的了解，加速育种进程。番茄是迄今为止维生素C 含量基因定位研究最多的植物，控制番茄维生素C 含量的QTL 已在3 个番茄品种中定位，这些品种来自栽培品种和相关野生种之间的杂交［12-14］，已确定MDHAR、GME、GLDH和GMP基因与控制9、10 号染色体上维生素C 含量的QTL 之间密切关联［14］。在苹果中检测到4 个与果皮和果肉维生素C 含量相关的QTL，这些QTL 解释了60%的总变异，单个QTL 贡献率高达31%［15］。草莓是维生素C 含量最高的作物之一，研究者在栽培草莓群体中检测到控制约45%总变异的3 个QTL，并在3 个生长季节评估了稳定性，其中2 个QTL 在至少2 年内被检测到，是草莓育种计划中MAS 的潜在候选QTL［16］。

【本研究切入点】目前，甜玉米维生素C 含量的研究主要集中在生理、保鲜等方面，关于遗传分析及分子辅助育种的研究鲜有报道。本试验以甜玉米自交系T15 和T77 为亲本配制杂交组合T15×T77，应用 SSR 分子标记技术，以200 个F2单株作为遗传作图群体构建遗传连锁图谱，结合F2各株的维生素C 含量，应用复合区间作图法对甜玉米籽粒维生素C 含量进行QTL 定位。【拟解决关键问题】对甜玉米维生素C 含量进行QTL 定位，以期为维生素C 含量的精细定位、主效基因克隆和高维C 甜玉米品种育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验使用的亲本T77（♀）和T15（♂）为仲恺农业工程学院农业与生物学院多年选育而成的纯合稳定的甜玉米自交系，这2 个自交系分别以引进的我国台湾甜玉米品种华珍和泰国甜玉米品种先甜5 号为基础材料，经8 代自交和鉴定自主选育的甜玉米自交系。

1.2 试验方法

2019 年3—6 月，在仲恺农业工程学院广州市番禺区钟村教学科研基地，以T15（♂）和T77（♀）为父母本进行杂交；2019 年9—12 月，对两亲本杂交产生的F1单株进行套袋严格自交，得到F2群体；2020 年3—6 月，种植2 个亲本各20株及来自同一果穗的216 个F2单株，最终选取200 株发育良好的F2植株进行表型及基因型分析。

1.3 甜玉米籽粒维生素C 含量测定

在甜玉米授粉后22 d 收获200 个F2果穗，检测维生素C 含量。将待测鲜果穗脱粒，每个果穗取6 个籽粒混合，准确称取组织重量，参考曾宪录等［17］方法，采用2,6-二氯靛酚滴定法测定维生素C 含量。结果取3 次重复的平均值。

1.4 DNA 提取和基因型分析

参照Paterson 等［18］方法，在喇叭口期提取P1、P2、F1以及F2的叶片DNA。在Wang 等［19］玉米SSR 引物中选取800 对高多态性SSR 引物，并根据前人玉米连锁遗传图谱设计引物［20-23］，设计好引物后交由上海生工生物工程公司合成。参考张姿丽等［24］方法进行PCR 扩增及产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳，鉴定F2各单株的标记基因型。

1.5 连锁群构建和QTL 定位

使用JoinMap3.0 软件分析标记与标记之间的连锁关系，构建分子遗传图谱［25］。使用Windows QTL Cartographer 2.5（http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm）程序结合复合区间作图法的检验方法，检测甜玉米维生素C 含量QTL，通过1 000 次随机抽样确定LOD 阈值（LOD ＞2.5）。通过以上两个软件，结合测定的F2维生素C 含量数据，在构建的分子遗传图谱上定位甜玉米维生素C 含量QTL，得到LOD 值、加性效应值、显性效应值、单个QTL 的表型贡献率。

1.6 维生素C 含量QTL 命名

QTL 命名按照McCouch 等［26］规则。按照一定的规律格式，即QTL+性状+染色体+QTL 个数，其中QTL 以小写“q”开始，采用与检验相匹配的英语简写来代表对应性状，比如维生素C 含量QTL 以Vc 表示，在染色体后加数字“1”来表示，如果有不相同的则继续用“2”、“3”、“4”等用来区别在同一染色体上所显示的多个不同位点QTL。

2 结果与分析

2.1 F2 群体维生素C 含量的正态分布检验

F2单株的维生素C 含量统计结果（图1）显示，F2群体维生素C 含量的平均值为39.28 mg/100g，变幅为23.59～47.12 mg/100g，标准差为3.79 mg/100g，变异系数9.64%，峰度为2.25，偏度为-1.10。从变幅和变异系数来看，F2各单株维生素C 含量没有较大变异；同时，从峰值、偏度和200 个F2单株维生素C 含量分布来看，维生素C 含量未显著偏离正态分布。这与QTL 定位检测的基本要求一致，因此，可以对这些数据进行QTL 检测。

图1 F2 群体维生素C 含量分布Fig.1 Distribution of vitamin C content in F2 population

2.2 甜玉米维生素C 含量的标记连锁图谱构建

根据大量国内外公开发表的相关文献［19-23］，结合玉米基因组数据库（http://www.maizegdb.org），选用均匀分布于玉米10 对染色体上的800 对SSR引物对两亲本和200 个F2单株进行SSR 标记基因型分析（图2）。在800 对SSR 引物中筛选出在两亲本T15 和T77 之间有多态性的引物174 对，进一步进行χ2 测验，选出169 对符合1∶2∶1 分离比的引物。应用Joinmap 3.0 软件对多态性位点进行遗传连锁关系分析，得到SSR 标记遗传连锁图谱，包含151 个位点，图谱长度为1 270 cM，每个标记间的平均间距为8.41 cM（图3）。

图2 甜玉米维生素C 含量QTL 峰图Fig.2 QTL peak map of vitamin C content in sweet corn

图3 甜玉米SSR 标记连锁遗传图谱及维生素C 含量QTL 分布Fig.3 SSR linkage genetic map and QTL distribution of vitamin C content in sweet corn

2.3 甜玉米维生素C 含量的QTL 定位

通过对甜玉米维生素C 含量基因进行QTL 定位，共检测到5 个QTL，分别位于第2、第3、第6 染色体，共解释55.41%的表型变异。其中，第2 染色体检测到1 个维生素C 含量QTL（qVC-ch.2-1），位于bin2.04～2.05 区域，标记落 在umc1465～umc1635 之 间，LOD 为9.57，加性效应值为2.23，表型贡献率为17.16%；第3 染色体检测到2 个维生素C 含量QTL（qVCch.3-1、qVC-ch.3-2），分别位于bin3.00～3.04、bin3.06～3.07 区域，标记分别落在umc1 746～bnlg1 144、dupssr23～umc1 148 之间，加性效应值分别为1.17、1.40，能分别解释6.64% 和4.15% 的表型变异；第6 染色体检测到2 个维生素C 含量QTL（qVC-ch.6-1、qVC-ch.6-2），分别位于bin6.05、bin6.05～6.06 区域，标记分别落在phi129～phi078、phi078～umc2 162 之间，加性效应值分别为0.43、1.83，能分别解释6.59%和20.87%的表型变异（图2、图3、表1）。

3 讨论

植物QTL 作图和效应估计已成为当前数量遗传学研究的重点之一，其研究方法是通过构建合适的作图群体，根据分子标记基因型分离与目标性状的关系分析，确定QTL 在连锁群上的位置，并估计其效应［27］。前人研究结果表明，植物维生素C 含量是一个受几个基因座控制的数量性状［12-16］。

目前已有对冬枣、辣椒、大豆芽菜、番茄等维生素C 含量QTL 定位的报道。王中堂［28］在冬枣中定位到与维生素C 相关的QTL 位点13 个，表型贡献率为18.1%～27%；谢立波等［29］在辣椒中定位到5 个与维生素C 相关的QTL，共解释59.03%的表型变异，同时发现辣椒中维生素C 的遗传模型为多基因加性-显性-上位性；陈俊［30］采用CIM 法在大豆芽菜中定位到4 个维生素C 含量QTL，共解释25%的表型变异；王彦华［31］检测到4 个番茄维生素C 含量QTL，共解释57.25%的表型贡献率。

关于甜玉米维生素C 含量的遗传研究鲜有报道。甜玉米营养价值高，不仅含有蛋白质、脂肪酸、氨基酸，还含有硒、钙、铜、铁、锌等微量元素［32］。研究表明，甜玉米的维生素C 含量是普通玉米的2 倍［33］。本研究共检测到5 个与甜玉米维生素C含量相关的QTL，其中第2 染色体检测到1 个相关QTL（qVC-ch.2-1），位于bin2.04～2.05 区域之间，可以解释17.16%的表型变异；第3 染色体检测到2 个相关QTL（qVC-ch.3-1、qVC-ch.3-2），分别位于bin3.00～3.04、bin3.06～3.07 区域，分别解释6.64%和4.15%的表型变异；第6 染色体检测到2 个相关QTL（qVC-ch.6-1、qVC-ch.6-2），分别位于bin6.05、bin6.05～6.06 区域，可以分别解释6.59%、20.87%的表型变异。本研究中，甜玉米维生素C 含量相关的5 个QTL 共同解释了55.41%的表型变异，其中有2 个QTL（qVC-ch.2-1、qVC-ch.6-2）贡献率＞10%，为主效QTL，各自解释17.16%和20.87%的表型变异。在本研究基础上，可继续进行不同年份、不同地点、不同组合、不同世代、不同群体的研究，以尽可能消除环境及遗传背景的影响，找出在不同环境和不同遗传背景下都存在的主效 QTL。前人研究表明，要检测到稳定的维生素C 含量相关QTL 位点，可采用不同群体在相同环境条件下进行QTL 分析，尽量减小环境条件的误差，以不同群体定位到的共同QTL 作为最终QTL 位点；也可以采用相同群体在不同环境条件下进行QTL 分析，以降低群体对定位结果的影响，以不同环境条件下的共同QTL 作为最终定位结果［34］。本研究所得到的5 个QTL所在区域标记密度不大，LOD 值均＞10，不能确定检测到的QTL 仅包含1 个效应较大的基因还是包含数个效应较小的基因。针对QTL 所在的染色体区域增加分子标记，可进一步对目标QTL 进行精细定位、克隆主效QTL、聚合有利基因以及分子标记辅助改良，为高维生素C 含量甜玉米育种提供参考依据。

4 结论

本研究以甜玉米自交系T15 和T77 为亲本配制杂交组合T15×T77，运用SSR 分子标记技术，以200 个F2单株作为遗传作图群体构建遗传连锁图谱，结合F2各株的维生素C 含量，应用复合区间作图法对甜玉米籽粒维生素C 含量进行QTL 定位，共检测到5 个与甜玉米维生素C 含量相关的QTL，累计共解释了55.41%的表型变异，其中有2 个QTL（qVC-ch.2-1、qVC-ch.6-2）贡献率＞10%，为主效QTL。