成纤维细胞生长因子20单克隆抗体的制备及鉴定

唐禄 董丽平 尹茉莉 刘磊 董媛 王会岩

（1. 吉林医药学院，吉林 132013；2. 吉林省抗体工程科技协同创新中心，吉林 132013）

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）是一类能促进成纤维细胞生长的蛋白质，目前为止已经发现的FGF家族共有23个成员［1］，分子量为17 kD-34 kD，成员之间的氨基酸序列同源性较高，多数成员来自中胚层和神经外胚层细胞［2］。广泛存在于人和动物体内，参与多种器官发育、血管新生、促有丝分裂、细胞迁移和分化等，现已广泛应用于组织创伤修复，美容创面修复、皮肤早衰等领域［3］。FGF20是FGF家族中的一员，与FGF9和FGF16属于同一亚家族［4］。2000年首次被Ohmachi等［5］发现，同年 Kirikoshi等［6］在人体中发现了FGF20，其成熟蛋白质由211个氨基酸组成，二级结构存在大量的β折叠。成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth gactor recepter，FGFR）属于酪氨酸激酶受体的一种［7-8］，FGF20通过与FGFR特异结合，启动相应的信号转导，从而发挥其生物学功能。FGF20在退行性神经系统疾病［9］、形态发生［10］、毛囊生长［11-12］、组织修复［13］等过程中发挥着重要作用。另外，FGF20的多态性还是中国汉族人群的PD 疾病的危险因素［14］。Jeffers等［15］利用实时定量PCR技术检测不同人肿瘤细胞中FGF20 mRNA表达情况，发现在肺癌、胃癌及结肠癌细胞中FGF20基因表达量最高，在正常组织中则是低表达；刘萍等［16-17］利用免疫组化检测结果显示，FGF20在大肠癌组织中异常表达，随后通过免疫组化和Western Blot检测，显示直肠癌中FGF20表达显著高于正常肠粘膜组织，且FGF20表达与结直肠癌组织的浸润及淋巴结转移显著相关。有研究发现，FGF20基因定位的8号染色体区域，发生突变后容易产生神经退行性疾病，胃癌和肺癌等疾病［18-19］。Fitzmaurice等［20］调查发现，2018年，全球共有2 450万癌症病例，导致了960万人死亡。我国2014年确诊的恶性肿瘤病例数为380.4万例，2019年约为392.2万例，增长率为3.2%。而肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌为最为常见的癌症，如果患者能在患病的早期就及时发现显得尤为重要。由于FGF20可在肺癌、胃癌及结肠癌细胞中过表达，可作为几种癌症潜在的肿瘤标志物，因此制备抗FGF20的高亲和力抗体，可以为肺癌和其他癌症早期诊断筛查及预后评估提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠骨髓瘤细胞株（SP2/0）为本实验室保存。大肠杆菌BL21（DE3）plysS购于北京全式金生物，载体由上海杰瑞生物工程公司合成构建。Balb/c小鼠购于长春生物制品研究所。

蛋白胨、酵母提取物购于英国OXOID公司；山羊抗鼠IgG-HRP抗体购于美国Abmart公司；商品化FGF20购于上海优宁维；亚型抗体检测试剂盒、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT购于美国sigma公司；胎牛血清购于美国BI公司；RPMI 1640培养基购于美国Gibco公司；SUMO酶（本实验室保存）；超滤管购于Millipore公司；25 cm2细胞培养瓶、75 cm2细胞培养瓶、96孔培养板和24孔培养板购于美国Corning公司；纯化填料和层析柱购于美国GE公司；Tris碱、NaCl等试剂均为国产。

1.2 方法

1.2.1 pET24a-SUMO-hFGF20表达载体的构建 根据GenBank数据库FGF20基因（ID：26281）序列的5′端添加SUMO基因序列，并在序列两侧设计Nde I、BamH I酶切位点，优化并合成基因序列。公司合成载体（由上海杰瑞完成）。重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）plysS感受态细胞中。涂布于含Kana+的LB平皿，37℃倒置培养12-16 h。

1.2.2 抗原的表达 从平皿中挑取单菌落，接种于 5 mL LB 培 养 基 中（Kana+，10 μg/mL），37℃、180 r/min振荡培养至A600达到0.8-1.0左右时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导目的蛋白表达，20℃、180 r/min振荡培养16 h，4℃、9 000 r/min离心15 min收集菌体。按照菌体∶裂解液（20 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA-2Na pH 8.2）1∶10的比例，重悬菌体超声破碎，功率为50%，工作4 s，间休6 s，超声30 min。离心收集上清和沉淀。SDS-PAGE分析蛋白表达情况。

1.2.3 抗原的纯化 大量制备菌体，加入裂解液溶解后，在低温条件下用高压均质机破碎菌体。4℃、20 000 r/min，离心 30 min，收集上清，0.45 μm滤膜过滤，上清液先用镍NTA亲和层析柱纯化，收集洗脱液，PBS溶液透析过夜，然后采用SUMO酶进行酶切。4℃条件下酶切16 h。酶切后样品再次经镍NTA亲和层析柱纯化，收集流出液，用超滤管（截流分子量10 kD）超滤置换溶液。收集的蛋白溶液纯度采用SDS-PAGE法检测，浓度用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定。

1.2.4 动物免疫 选择7-8周龄雌性Balb/c小鼠3只（20±2）g，将FGF20蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合乳化，通过颈背部多点皮下注射进行首次免疫（100 μg/只小鼠）。两周后进行第2次免疫，FGF20蛋白与弗氏不完全佐剂（剂量与首次相同）乳化后颈背部多点注射。3次免疫后，小鼠尾静脉收集血清，用间接ELISA检测血清中抗体效价。选取一只最佳免疫的小鼠，融合前3 d腹腔注射抗原作加强免疫（剂量同前）。本实验已通过吉林医药学院动物伦理委员会审查（编号：2021-LW004）。

1.2.5 杂交瘤细胞的建立与筛选 首先制备饲养层细胞，取1只未免疫的Balb/c小鼠，处死后置于75%乙醇溶液中浸泡5 min，在超净工作台内操作暴露腹膜。用预热RPMI-1640培养液冲洗腹腔并收集冲洗液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬细胞，细胞计数，将浓度调至1×105个/mL，每孔100 μL，37℃，5% CO2培养箱中过夜。取对数生长期SP2/0细胞，离心重悬后细胞计数。另取血清效价最高的BALB/c小鼠，脱颈处死后75%乙醇浸泡5 min，取脾脏研磨，200目滤网过滤，收集脾细胞。脾细胞和SP2/0细胞以2∶1的比例混合，离心弃上清，滴入50%的PEG溶液 1 mL，静置45 s后，加入RPMI-1640细胞培养液终止PEG作用。用含10%胎牛血清和HAT的RPMI-1640细胞选择培养液重悬，96孔板中每孔200 μL，37℃，5% CO2培养。待细胞融合后，第4天更换培养液，第7天筛选融合细胞（取细胞上清，采用间接ELISA法筛选融合细胞），用酶标仪在450 nm测定吸收值，阳性/阴性值（P/N）大于2.1作为阳性细胞。通过有限稀释法进行3-4次亚克隆。

1.2.6 单克隆抗体的纯化 取3只适龄的Balb/c小鼠，预先腹腔注射0.5 mL石蜡制敏小鼠，1周后腹腔注射杂交瘤细胞（2×106个/0.5 mL），观察腹水产生情况，10 d后收集腹水。4℃，12 000 r/min，离心30 min，收集上清，0.45 μm滤膜过滤，4℃保存待用。收集的腹水样品先用等体积的10 mmol/L PBS（pH 7.4±0.2）溶液稀释，protein G亲和层析柱纯化，先用10 mmol/L PBS（pH 7.4±0.2）预平衡层析柱10个柱体积，然后上稀释后腹水样品，上样结束后再用PBS溶液平衡至基线稳定。用0.1 mol/L甘氨酸溶液（pH 3.0）洗脱，收集样品，离心管中预先加入1 mol/L Tris溶液（pH 9.0），收集的蛋白样品用超滤管（截留分子量10 kD）进行浓缩换液。收集的蛋白溶液纯度采用SDS-PAGE法检测。

1.2.7 单克隆抗体的分析检测

1.2.7.1 ELISA法测定抗体效价 将纯化的FGF20蛋白包被 ELISA 板（5 μg/mL，100 μL/孔），4℃孵育过夜，洗涤液洗板3次，用封闭液稀释待测抗体，加入到ELISA板中100 μL/孔，稀释倍数分别为1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800，100 μL/孔，37℃孵育 40 min，洗涤液洗板3次，再加入山羊抗鼠IgG-HRP二抗（稀释比例为1∶8 000）100 μL/孔，37℃孵育30 min，洗涤液洗板3次；加TMB显色液100 μL/孔，室温避光孵育3-10 min，每孔加50 μL终止液终止反应，用酶标仪在450 nm下检测每孔吸收值。

1.2.7.2 抗体亚型分析 按照sigma鼠单克隆抗体亚型检测试剂盒使用说明书，检测纯化后的抗体，鉴定单克隆抗体的亚型，具体步骤参照试剂盒说明书。

1.2.7.3 Western Blotting检测 配制12%的SDSPAGE胶，将等量纯化FGF20蛋白与商品化FGF20上样进行电泳，电泳结束后，将目的蛋白转印到PVDF膜上（恒流300 mA，1 h），然后用封闭液（含5%脱脂奶粉+TBST）溶液室温封闭PVDF膜1-2 h，加入封闭液稀释后的纯化抗体（1∶5 000稀释），4℃孵育过夜，第2天用TBST溶液洗涤PVDF膜3次后，加入用TBST溶液稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgGHRP二抗（1∶5 000稀释），室温孵育1 h后，TBST溶液洗涤3次，最后用ECL曝光液曝光。用伯乐ChemiDoc MP凝胶成像系统拍照检测。

1.2.7.4 Surface Plasmon Resonance（SPR）测定抗体亲和力 SPR实验使用BIAcore T200仪器，在HBSEP缓冲液（10 mmol/L HEPES、150 mmol/L NaCl、3 mmol/L EDTA、0.005%聚山梨醇酯20，pH 7.4）中进行。通过胺偶联反应将FGF20蛋白固定在CM5芯片上，使其保持充分的配体结合能力。采用控制流通道作为基准面进行体效应的减法。增加浓度的抗体注射对固定化和参考通道，然后用再生液（2 mol/L NaCl，10 mmol/L醋酸钠，pH 4.5）处理芯片。最后用BIA Evaluation软件对数据进行评估，根据拟合的饱和结合曲线计算平衡离解常数Kd。

2 结果

2.1 重组蛋白的诱导表达和纯化

构建的重组质粒经Nde I、BamH I双酶切后，DNA电泳结果显示（图1），在1 000 bp附近处有一条明显的条带，与预计大小相符。工程菌pET24a-SUMO-hFGF20经过IPTG诱导后，SDS-PAGE结果显示，在相对分子量为37 kD出现一条明显的条带，与预期结果一致，显示目的蛋白在上清中表达（图2）。均质破碎后离心样品通过镍NTA亲和层析柱，捕获到SUMO-FGF20融合蛋白，按比例用SUMO酶酶切后，样品再经过镍NTA亲和层析柱，收集穿出液即获得目的蛋白（图3）。

图1 质粒双酶切图Fig.1 Double enzyme digestion of plasmid

图2 工程菌可溶性分析电泳图Fig.2 Electrophoregram analysis of soluble of engineere bacteria (SDS-PAGE)

图3 FGF20纯化电泳图Fig.3 Electrophoregram analysis of purified FGF20

2.2 抗体的纯化

通过多次有限稀释进行克隆化筛选，获得1株稳定分泌表达FGF20单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为17G3。将杂交瘤细胞株扩增培养后，注射到小鼠腹腔内诱发产生腹水，收集腹水并分离纯化。还原型SDS-PAGE结果显示（图4），分子量为25 kD和50 kD有两条带，分别对应抗体的轻链与重链。通过凝胶成像软件分析，纯度达到95%以上。

图4 抗体纯化电泳图Fig.4 Electrophoregram analysis of purified monoclonal antibody

2.3 单克隆抗体的检测

2.3.1 抗体效价和亚型的分析检测 收集杂交瘤细胞产生的小鼠腹水，用间接ELISA检测（n=3）纯化后17G3抗体效价，以样品OD450大于等于阴性对照OD值2.1时，所对应的最大稀释倍数为抗体的效价，结果显示纯化后抗体效价为1∶25 600（图5），经ELISA亚型检测后，杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体亚型为IgG1（图6）。

图5 抗体效价分析检测Fig.5 Antibody titer assay

图6 抗体亚型分析检测Fig.6 Antibody subgroup assay

2.3.2 Western Blot分析检测 Western Blot结果显示（图7），在相对分子量为23 kD处可以曝光出条带，且两条带位置相同，说明免疫纯化得到的17G3抗体既可以与自制的抗原结合，又能与商品化的FGF20抗原结合，抗原抗体特异性较好。

图7 Western Blot分析Fig.7 Western Blot assay

2.3.3 表面等离子共振技术（SPR）检测抗体与FGF20结合动力学特性 将FGF20抗原偶联到CM5芯片上，利用BIAcore T200 system对抗原抗体进行亲和力检测，检测结果显示离解速率常数（Kd）为1.07×10-7mol/L（图8），结果表明17G3抗体与FGF20表现出极强的亲和力和稳定性。可以用于后续癌细胞的诊断或者靶向治疗。

图8 SRP检测抗体与FGF20结合动力学特性Fig.8 Kinetic assay on antibody binding to FGF20 antigen by SPR

3 讨论

目前随着恶性肿瘤的发病率不断增高，肿瘤疾病的诊断，治疗方法也在不断进步，单克隆抗体由B淋巴细胞克隆产生，具有高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。在疾病研究及诊断中，单克隆抗体由于其特异性强、均一性好、可大量生产等优点，广泛应用于感染性疾病的诊断、肿瘤诊断及预后判断等方面。作为治疗性抗体药物，由于专一性强、疗效显著，也可以携带特定药物，通过靶向作用到特定作用位点，用来干预癌症发生发展过程中的各个信号通路，成为近年来研究的热点药物之一。因此，单克隆抗体是重要的研究工具，诊断试剂和临床治疗手段。目前国内科研，生产检测所用到的单克隆抗体，基本为国外进口垄断，价格不菲，因此自主研发制备高质量的单克隆抗体显得十分重要。

有研究表明，FGF20可以与不同的受体结合，从而产生不同的功能。FGFR2介导的信号途径在癌症发展的过程中起到重要作用，FGF20可以与FGFR2结合，从而激活一系列信号活动，进而影响肿瘤的发生发展［21-23］。Chamorro等［24］发现，FGF20是β-catenin的直接下游靶基因，突变的β-catenin能使RK3E细胞发生致瘤性转化，说明在Wnt信号通路中，FGF20是促使肿瘤形成的关键因素。Katoh等［25］研究显示，在胃肠道中，FGF18、FGF20和SPRY4是Wnt信号通路的有效靶点。另外，Katoh［26］研究发现 FGF20、JAG1 和 DKK1 是 Wnt/βcatenin信号级联的靶基因，Wnt和FGF信号通路的串扰增强了β-catenin和NFAT信号级联。同时姜治国［27］发现，FGF20高表达在肝癌的发生发展过程中有重要的生物学作用，可能是Wnt/β-catenin信号通路被异常激活。Wnt/β-catenin信号通路的负调节的表观遗传沉默和功能突变存在于多种人类癌症中，这可能是由于β-catenin的累积导致细胞膜上的表达量减少［23］。目前关于FGF20的单克隆抗体的研究，未见相关报道。总之，随着不断的深入研究，制备抗FGF20单克隆抗体，无论是作为肿瘤诊断，还是作为靶向治疗都具有潜在的临床应用价值。

本研究通过大肠杆菌原核表达系统，成功构建表达FGF20工程菌，经过诱导表达，分离纯化获得了高纯度的目的蛋白，通过免疫小鼠制备鼠单克隆抗体，有限稀释法筛选获得了1株阳性杂交瘤细胞株，抗体经过ELISA效价，WB和SPR检测，结果显示可以与自制的FGF20目的蛋白和商品化的FGF20蛋白结合，自制单克隆抗体与FGF20目的蛋白的亲和力Kd值达到1.07×10-7mol/L。该杂交瘤细胞株表达的抗体，可用于对组织细胞中FGF20蛋白表达检测，癌细胞诊断，或者靶向治疗等研究。本课题组后续会进一步进行FGF20单克隆抗体的筛选、配对和FGF20多克隆抗体的制备工作，为开发快速检测FGF20的检测试剂盒做准备。

4 结论

本研究通过构建表达FGF20的原核载体，并在大肠杆菌BL21（DE3）plysS中进行表达，通过分离纯化获得重组蛋白，通过免疫小鼠，有限稀释法进行单克隆筛选，获得1株稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株，通过ELISA、WB等对抗体进行分析鉴定。