肝脏TM6SF2特异性敲除促进非酒精性脂肪性肝病小鼠肝脏脂肪变性

张 杰，马学峰，王艺奋，王孟轲，庄立琨，刘守胜，辛永宁,3

1 青岛大学附属青岛市市立医院 感染性疾病科，山东 青岛 266011；2 青岛大学附属青岛市市立医院临床研究中心，山东 青岛 266071；3 青岛市消化疾病重点实验室，山东 青岛 266071

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种以肝细胞内脂质过度沉积为主要特征的临床病理综合征[1-2]，目前已成为全球范围内发病率最高的慢性肝脏疾病[3]。系统研究NAFLD的发病机制对于其防治至关重要。NAFLD是一种由遗传、饮食和肠道微生态等多种因素共同作用的复杂疾病[4-5]，近年来遗传因素在NAFLD发病中的作用引起越来越多重视。Kozlitina等[6]发表的一项外显子组关联研究发现，跨膜蛋白超家族6成员2基因(transmembrane 6 superfamily member 2，TM6SF2)编码蛋白的E167K多态性在NAFLD发生发展过程中起重要作用。TM6SF2属于跨膜蛋白超家族成员，主要在肝脏、小肠、肾脏等器官高表达。随后的人群试验[7-9]也进一步证实TM6SF2 E167K多态性是NAFLD的一个致病风险因子。

本研究构建了TM6SF2肝细胞特异性敲除(TM6SF2-HKO)小鼠模型，发现在高脂饮食条件下，TM6SF2-HKO小鼠的肝质量、肝指数、ALT、胰岛素水平及肝脏TG水平均高于对照组小鼠，证明了肝细胞敲除TM6SF2可加重高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性和肝损伤，为研究TM6SF2在NAFLD中的长期作用奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 肝组织特异表达Cre重组酶转基因(Alb-Cre)小鼠由张令强教授(北京军事医学研究院)赠送。8周龄雄性TM6SF2-HKO小鼠和对照小鼠(TM6SF2-Flox)(各4只/组)给予高脂饮食(60%脂肪)16周建立NAFLD模型，TM6SF2-HKO小鼠和TM6SF2-Flox小鼠(各8只/组)给予普通饮食16周作为对照。所有小鼠维持12 h明/暗周期并自由摄入食物和饮用水。建模完成，小鼠禁食6 h后给予安乐死。

1.2 嵌合体F0代阳性小鼠的获得 通过CRISPR/Cas9系统构建TM6SF2基因条件性敲除小鼠模型。构建针对小鼠TM6SF2基因的sgRNA、Cas9 mRNA和携带LoxP片段的donor载体。利用TM6SF2特异性sgRNA指导Cas9核酸酶在内含子2和内含子3中剪切DNA双链，通过同源重组修复将LoxP序列整合到两位点。将sgRNA、Cas9 mRNA和donor载体共同注入雌鼠受精卵中，将受精卵植入到假孕的小鼠子宫中。所得子代通过PCR鉴定基因型，挑选出F0代阳性小鼠。雄性F0代小鼠与野生雌鼠交配，获得F1代嵌合体小鼠。

1.3 小鼠基因型鉴定的方法 剪取小鼠尾尖于离心管中，加入70 μl裂解液A液(25 mmol/L NaOH，20 μmol/L EDTA)，95 ℃金属浴45 min后，加入70 μl的裂解液B液(40 mmol/L Tris-Cl)，充分研磨组织，离心所得上清液即为基因组DNA，以该DNA为模板进行PCR扩增，引物序列见表1。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带判断其基因型。

表1 基因型鉴定对应的引物序列

1.4 RNA提取和定量(q)RT-PCR分析 使用RNAiso(Takara，日本)从各组织中提取总RNA，使用PrimeScriptTM试剂盒(Takara，日本)将RNA逆转录成cDNA，利用SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen，德国)以β-Actin为内参定量TM6SF2基因在各组织的表达量。用到以下引物，TM6SF2：5′-CGGACTGGGCCTTGGTATTT-3′，5′-CTTGGTCCTGTGGCGAAGAT-3′；β-Actin：5′-CAGCTTCTTTGCAGCTCCTT-3′，5′-CACGATGGAGGGAATACAG-3′。

1.5 口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test，OGTT) 小鼠禁食6 h后，测量小鼠尾静脉血糖。按照2 mg/kg的剂量给予小鼠灌胃葡萄糖[10]，记录小鼠灌胃后30 min、60 min和120 min时间点的血糖值。

1.6 小鼠血液相关指标检测 小鼠禁食后，按照0.01 mL/g的剂量腹腔注射4%水合氯醛，麻醉后取其静脉血，根据试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)所述方法检测血浆中AST、ALT、TG、TC及胰岛素水平。

1.7 小鼠肝脏TG检测 称量10 mg小鼠肝组织，加入90 μL无水乙醇，充分研磨组织，离心后取上清液，使用TG检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)检测肝脏TG水平。

1.8 伦理学审查 所有动物实验均按照青岛大学附属医院医学实验动物伦理委员会批准的指导原则进行。实验动物生产许可证：SCXK(苏)2018-0008，实验动物使用许可证：SYXK(鲁)2020 0009，伦理审批编号：AHQU-MAL20180504。

2 结果

2.1 TM6SF2-HKO小鼠的获得与鉴定 为探究TM6SF2在NAFLD发生发展中的作用，使用CRISPR/Cas9系统构建了TM6SF2条件性敲除小鼠，构建策略如图1所示。按Cre/LoxP繁殖策略，获得的子代小鼠通过PCR鉴定其基因型(图2)。提取TM6SF2-HKO小鼠和TM6SF2-Flox小鼠肝脏以及心、肾、小肠等组织RNA，发现除肝脏外(t=5.823,P=0.028)，其他组织TM6SF2表达水平差异均无统计学意义(P值均>0.05)，证明在TM6SF2-HKO 小鼠中，TM6SF2在肝细胞特异性敲除(图3)。

图1 TM6SF2-CKO小鼠构建策略

注：a,TM6SF2fl/fl鉴定,电泳仅有一条332 bp条带，则为TM6SF2fl/fl纯合小鼠；仅有一条239 bp条带，则为TM6SF2-/-野生小鼠；若两条带都存在，则为TM6SF2fl/-杂合小鼠。b,Alb-Cre鉴定，若有一条279 bp条带，则为Cre转基小鼠。因此，42号为TM6SF2-HKO小鼠(TM6SF2fl/fl Alb-Cre)，45号为TM6SF2-Flox小鼠(TM6SF2fl/fl)。

图3 TM6SF2-HKO和TM6SF2-Flox小鼠各组织TM6SF2表达水平

2.2 高脂饮食下TM6SF2-HKO可增加小鼠肝指数及ALT水平 TM6SF2-HKO小鼠构建成功后，给予两组小鼠高脂饮食以探究其一般情况差异。结果发现普通饮食及高脂饮食下，TM6SF2-HKO和TM6SF2-Flox小鼠体质量差异无统计学意义(P值均>0.05)。高脂饮食时，TM6SF2-HKO组小鼠肝质量、肝指数高于TM6SF2-Flox组(P值均<0.01)，而普通饮食时差异均无统计学意义(P值均>0.05)。检测血浆中与肝损伤相关的ALT和AST水平，发现给予高脂饮食时，TM6SF2-HKO组血浆ALT水平较TM6SF2-Flox组升高(P<0.01)，AST水平差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 TM6SF2-HKO对小鼠肝质量、肝酶等指标影响

2.3 TM6SF2-HKO促进血浆胰岛素水平升高 肝脏对于调节葡萄糖稳态起重要作用，检测糖代谢相关指标，发现在普通饮食和高脂饮食的条件下，TM6SF2-HKO和TM6SF2-Flox组空腹血糖无差异(P值均>0.05)，TM6SF2-HKO组血浆胰岛素水平较TM6SF2-Flox组升高(P值均<0.05)。给予小鼠灌胃葡萄糖，发现在30、60和120 min时，两组小鼠血糖及OGTT对应曲线下面积差异均无统计学意义(P值均>0.05)，胰岛素抵抗指数差异也无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3 肝细胞TM6SF2缺失对小鼠糖代谢影响

2.4 高脂饮食下TM6SF2-HKO可加重肝脏脂肪变性 进一步检测脂代谢相关指标，发现在普通饮食和高脂饮食条件下，TM6SF2-HKO组和TM6SF2-Flox组之间血浆TC、TG水平差异均无统计学意义(P值均>0.05)。高脂饮食时，TM6SF2-HKO小鼠肝组织TG水平高于TM6SF2-Flox小鼠(P<0.05)(表4)。HE染色发现TM6SF2-HKO组脂滴数量和大小高于TM6SF2-Flox组(图4)。油红O染色结果表明，高脂饮食增加了肝脏红染面积，TM6SF2-HKO组红染面积高于TM6SF2-Flox组(图5)。

注：a，TM6SF2-Flox-CD；b，TM6SF2-HKO-CD；c，TM6SF2-Flox-HFD；d，TM6SF2-HKO-HFD。

注：a，TM6SF2-Flox-CD；b，TM6SF2-HKO-CD；c，TM6SF2-Flox-HFD；d，TM6SF2-HKO-HFD。

表4 TM6SF2-HKO对小鼠脂代谢影响

3 讨论

全身敲除小鼠模型可导致全部体细胞内靶基因缺失，可能存在胚胎发育异常、纯合致死等问题，而条件性敲除小鼠模型可以特异性敲除某个特定组织或器官中的靶基因，以研究该基因在特定组织或器官中的作用[11]。Fan等[12]通过TM6SF2全身敲除的小鼠模型、肝脏特异性过表达人源TM6SF2基因的小鼠模型，Kozlitina等[6]利用腺病毒特异性敲低肝细胞TM6SF2的小鼠模型探究TM6SF2在NAFLD中的作用，但其在肝脏的生理功能并未达成共识。CRISPR/Cas9技术具有简单、快速、高效的优势，逐渐成为靶向基因组编辑的主要工具[13]，被应用于动物模型的构建等方面[14]。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了稳定的TM6SF2-HKO小鼠模型，以研究肝脏TM6SF2在NAFLD发生发展中的作用。

血清ALT、AST水平升高被认为是判断急性肝损伤严重程度的重要指标[15-16]。本研究中高脂饮食条件下，TM6SF2-HKO小鼠血浆ALT水平高于TM6SF2-Flox小鼠，表明敲除肝脏TM6SF2在高脂喂养时可加重小鼠肝损伤。血浆AST水平无差异，可能是由于ALT反映早期肝细胞损伤，而AST反映较严重肝细胞损伤[15,17]，肝脏病理学同样证明在高脂饮食条件下，TM6SF2-HKO加重了肝细胞损伤程度。肝脏产生的葡萄糖约占内源性葡萄糖产量的90%，这对葡萄糖稳态的调节至关重要[18]，NAFLD与胰岛素抵抗和2型糖尿病密切相关[19]。检测肝脏TM6SF2对糖代谢的影响，发现在普通饮食和高脂饮食下，TM6SF2-HKO小鼠胰岛素水平较对照组升高，并可能导致了本研究观察到的其血糖水平稍低于对照组，提示肝脏敲除TM6SF2后可能通过改变胰岛素水平进而调节糖代谢。

NAFLD以肝细胞内脂质过度沉积为主要特征，可导致肝质量、肝指数等指标改变。本研究中喂养TM6SF2-HKO小鼠高脂饮食16周，小鼠肝质量、肝指数和肝脏TG水平均较对照组升高，表明肝脏特异性敲除TM6SF2可促进高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性，TM6SF2的表达水平是代谢稳态的一个重要决定因素。已发表的TM6SF2全身敲除小鼠模型中，高脂饮食喂养12周后小鼠肝指数无变化[12]，推测可能是由于本研究为肝细胞特异性敲除或全身敲除模型中高脂喂养仅12周而脂肪变性程度低所致。本研究中TM6SF2-HKO小鼠血浆TC水平较对照组无差异，而全身敲除小鼠的血浆TC水平较对照组下降[9]。可能是由于TM6SF2不仅在肝脏中高表达，在小肠中也高表达，小肠参与了部分TC合成过程，导致TM6SF2-HKO模型和全身敲除模型结果不一致。本研究还发现，在高脂饮食条件下，两组小鼠血浆TG水平降低，但无统计学差异，肝脏中TG水平升高。这与腺相关病毒敲低肝脏TM6SF2小鼠表型基本一致[6]。根据肝脏敲除TM6SF2对TG的影响，笔者推测肝脏敲除TM6SF2可能导致血浆TG更多的转化为肝脏TG，进而导致肝脏脂质蓄积增加。相较CRISPR/Cas9系统和Cre/LoxP策略，腺相关病毒敲低基因虽耗时较短，但敲低效果不稳定。相比而言，利用CRISPR/Cas9系统和Cre/LoxP策略特异性敲除肝脏TM6SF2可得到更稳定敲除的小鼠模型。笔者通过肝脏病理诊断发现高脂喂养的小鼠肝脏出现典型的大泡小泡混合性脂肪变，但无明显的小叶炎症和气球样变性，表明在高脂饮食时肝脏敲除TM6SF2可加重小鼠单纯性脂肪变，但并未观察到相关非酒精性脂肪性肝炎表型。

本研究利用CRISPR/Cas9系统和Cre/LoxP策略构建稳定的TM6SF2-HKO的小鼠模型，并研究其在NAFLD发生发展中的作用。研究发现在高脂饮食条件下，肝细胞TM6SF2缺失可增加小鼠的肝质量、肝指数、ALT水平和肝内TG水平，证明TM6SF2-HKO可加重肝脏脂肪变性和肝损伤程度，进一步证实肝脏TM6SF2在NAFLD发生发展过程中起重要作用。本研究探究了肝脏TM6SF2在NAFLD发生发展过程中的长期作用，为今后进一步研究TM6SF2在NAFLD中的作用奠定基础。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：张杰进行课题设计与实施、撰写论文；马学峰、王艺奋进行课题实施；王孟轲数据收集，参与起草文章；庄立琨、刘守胜进行课题设计，参与修改文章关键内容；辛永宁进行课题设计和实验指导。