等热量低碳高蛋白饮食结合有氧运动干预非酒精性脂肪性肝病的血清代谢组学分析

李美莺，纪万里，刘王振祖，汪 涛，杜晟楠，高静静，蒋元烨，胡 诚

1 上海市普陀区中心医院 a.健康管理中心，b.消化内科，上海 200062；2 上海健康医学院 药学院，上海 201318；3 上海中医药大学 a.中药学院，b.科技实验中心，上海 201203

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是目前临床最常见的慢性肝病，其与胰岛素抵抗和遗传引发的代谢应激性损伤密切相关，包括非酒精性单纯性肝脂肪病变、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝细胞癌[1-2]。随着人们饮食和活动方式的改变，患病率呈逐年上升趋势，给人们的健康和生命安全带来了巨大威胁，是导致全球卫生问题和经济负担的重要因素[3]。目前对于NAFLD的治疗尚无相关的特效药物治疗，更多的是通过合理的饮食和运动进行早期干预以改善NAFLD的症状[4-6]。改变不良生活方式、减少体质量和腰围是预防和治疗NAFLD及其并发症最为重要的治疗措施。因此，相比于药物治疗，笔者认为碳水化合物限制饮食及适当运动是广泛推荐的干预措施，适用于大多数NAFLD患者。

越来越多的研究[7-9]表明NAFLD与代谢功能紊乱密切相关，缺乏敏感而靶向的临床诊断生物标志物给NAFLD的临床诊治，尤其是早期诊断及随访策略的制订带来了一定的挑战。随着现代分析技术的发展，包括代谢组学在内的各种测序技术业已广泛应用于研究NAFLD的发病机制。代谢组学通过对样本进行高通量测序，可以发现代谢产物、代谢途径和规律[10-11]。本文以NAFLD患者为研究对象，收集等热量低碳高蛋白饮食结合有氧运动干预前后的血清，采用超高效液相色谱串联高分辨质谱(UPLC-Q-Orbitrap/MS)进行血清代谢组学研究，以探求干预前后的血清生物标志物与代谢途径的差异，为指导临床医生为NAFLD患者制订合理的饮食及运动策略提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2019年1月—2020年1月在上海市普陀区中心医院消化科及住院部诊断为NAFLD的患者23例，另外选择13例体检确定为身体健康的志愿者作为健康对照组，基本资料包括姓名、性别、年龄、住院号/门诊号、身高、体质量、腰围、临床诊断、现病史、既往史、输血史、家族史等。参照2010年中华医学会《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》[12]，NAFLD诊断需符合以下三项：(1)无饮酒史或饮酒折合乙醇量男性<210 g/周，女性<70 g/周；(2)除外病毒性肝炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性、自身免疫性肝病等可导致脂肪肝的特定疾病；(3)肝活检组织学改变符合脂肪性肝病的病理学诊断标准。NAFLD定义为：(1)肝脏影像学的表现符合弥漫性脂肪肝的诊断标准且无其他原因；(2)有代谢综合征相关表现的患者出现不明原因的血清ALT、AST或GGT持续增高半年以上。减肥和改善胰岛素抵抗后，异常酶谱和影像学脂肪肝改善甚至恢复正常者符合NAFLD诊断标准。

1.2 纳入和排除标准

1.2.1 纳入标准 (1)年龄16～75周岁；(2)每周酒精摄入男性不超过210 g，女性不超过70 g；(3)B超或CT检查存在脂肪肝的影像学改变；(4)排除病毒性肝炎、药物性肝病、自身免疫性肝病及其他自身免疫性疾病、甲状腺疾病等其他导致脂肪肝的情况；(5)既往无重大胃肠道手术史，如胃大部切除及胃肠吻合术、结肠癌根治术、小肠切除术等，阑尾切除术、消化性溃疡穿孔修补术等除外；(6)无严重心、肺、脑、肾疾病及恶性肿瘤；(7)女性排除妊娠或近期有受孕意愿者。

1.2.2 排除标准 (1)合并有肝外纤维化疾病包括系统性红斑狼疮、风湿类疾病、肾衰竭、慢性阻塞性肺疾病、肿瘤类疾病、糖尿病等；(2)排除合并甲、乙、丙、丁、戊型病毒性肝炎感染；酒精性肝病、自身免疫性肝病、胆汁淤积性肝病、药物性肝损伤、遗传代谢性肝病以及晚期肝硬化合并肝脏肿瘤者；(3)正在进行或既往接受过抗肝纤维化治疗或抗病毒治疗者，服用过降酶药物者；(4)有黄疸、ALT或AST超过正常值上限2倍及以上；(5)与本研究相关的临床资料数据不完整的患者。

1.3 研究方法

1.3.1 仪器和试剂 乙腈和甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，购自Thermo Fisher Scientific。超高效液相串联高分辨质谱(UPLC-Q-Orbitrap/MS, Thermo)；超高效液相串联三重四级杆质谱(UPLC-MS/MS, AB SCIEX)；超高效液相仪(H-Class, Waters)；1730R冷冻高速离心机(德国GENE有限公司)；TARGINTMVX-Ⅱ多管漩涡振荡器(北京踏锦科技有限公司)；Milli-Q纯水机[默瑞(上海)生物科技有限公司]；FA2004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

1.3.2 生活方式干预 剧烈强度运动指运动时心率为最大心率(HRmax)的60%～80%, 运动时心率为HRmax的45%～55%为中等强度运动。故本研究选用中等强度运动，HRmax计算公式为:HRmax=220-年龄(岁)，根据HRmax计算出每个患者运动时的目标心率。选择的有氧运动干预具体方法为：每周运动3次(每周一、三、五，可根据患者自身情况略微调整)，每次运动时间为50 min，每周共为150 min。首先为10 min热身运动，包括肢体拉伸和慢走；然后为持续40 min的跑步，保证目标心率维持30 min。本课题组有专门负责指导入组患者有氧运动的医生，保证每周至少1次随访患者，并记录相关数据。

根据基础代谢率估算每个受试者的能量需求(使用Harris Benedict方程)，乘以相应于受试者活动水平的1.5。研究饮食提供了来自碳水化合物的大约4%的能量，来自脂肪的72%的能量和蛋白质的24%的能量，饮食中的碳水化合物含量限制在23～30 g/d，记录基线饮食的常量营养素含量。

因此，本研究设定运动时间为4周，从而避免体质量的减轻对试验产生干扰。所有入组患者进行运动饮食干预，均在入组时及4周后检测体质量、腰围、肝功能、血脂、血糖。

1.3.3 剔除标准 (1)有氧运动组患者1周内无3次有氧运动者；(2)等热量低碳高蛋白饮食组患者随意进食者；(3)无任何有氧运动组患者连续2天进行有氧运动者；(4)试验过程中出现不能耐受有氧运动者。

1.3.4 代谢组学研究

1.3.4.1 血清处理 采集健康志愿者和脂肪肝患者经运动饮食干预前后清晨空腹静脉血10 mL，4 ℃静置2 h后3000 r/min离心15 min，吸取上清液，于-80 ℃冰箱冻存。取解冻后的血清样品100 μL加入400 μl 甲醇，涡旋振摇1 min充分提取后，在4 ℃条件下以12 000 r/min 离心10 min，将上清转入进样小瓶待测。

1.3.4.2 色谱条件 色谱柱：C18色谱柱(Hypergod C18，100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流速0.3 mL/min；柱温：40 ℃；流动相组成为A：纯水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.3.4.3 质谱条件 正离子模式：加热器温度300 ℃；鞘气流速：45 psi；辅助气流速：5 L/min；尾气流速：0.3 L/min；电喷雾电压：3.0 kV；毛细管温度：350 ℃；S-Lens RF Level，30 %。负离子模式：加热器温度300 ℃；鞘气流速：45 psi；辅助气流速：5 L/min；尾气流速：0.3 L/min；电喷雾电压：3.2 kV；毛细管温度：350 ℃；S-Lens RF Level，60 %。

1.4 伦理学审查 本研究方案经由普陀区中心医院伦理委员会审批，批号：PTEC-A-2018-49-1。所纳入患者均签署知情同意书。

2 结果

2.1 基本资料分析 健康对照组的BMI及体质量明显低于干预前NAFLD组患者(P值均<0.05)，两组间腰围差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。NAFLD患者经生活方式干预后，BMI、体质量及腰围下降不显著(表3)。

2.2 血清生化指标分析 检测各组血清生化指标发现，健康对照组Alb、GGT、ALT、GLU表达水平明显低于干预前NAFLD患者(P值均<0.05)(表2)。经生活方式干预后，NAFLD患者Alb、GGT、ALT表达水平较干预前降低(P值均<0.05)，ChE、AST、GLU水平差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表3)。

2.3 血脂水平分析 血脂水平检测分析发现，健康对照组TC、TG表达水平明显低于干预前NAFLD患者(P值均<0.05)(表2)。经生活方式干预后，NAFLD患者的血清中TG、TC水平均较干预前降低(P值均<0.05)，HDL-C、LDL-C改善不显著(P值均>0.05)(表3)。

表2 2组基线资料及血清生化参数比较

表3 NAFLD组干预前后临床资料及血清生化参数比较

2.4 血清代谢物差异分析 运用SIMCA14.0软件对健康对照组、NAFLD生活方式干预前及干预后的血清代谢物进行PCA分析，结果发现健康对照组和NAFLD生活方式干预前后组的代谢表型有较好的区分，NAFLD患者经生活方式干预前后代谢产物显示出明显差异性(图1)。进一步采用OPLS-DA评分发现同NAFLD生活方式干预前相比，干预后血清代谢物出现明显分离，表明两组代谢产物差异明显(图2)，说明这些代谢产物有可能是NAFLD生活方式干预的靶向代谢产物。

图1 健康对照组及NAFLD患者运动饮食干预前后的PCA

图2 NAFLD患者运动饮食干预前后的OPLS-DA

2.5 生物标志物热图分析 将OPLS-DA模型中VIP值>1的血清生物标志物进行统计分析，并结合t检验(P<0.05)为靶标筛选依据对NAFLD生活方式干预前后的生物标志物靶标进行筛选。结果发现33种代谢物发生了显著变化(图3)，其中包括Oleoyl-L-α-lysophosphatidic acid, Stearic acid，Sulcatone，Oleamide，Linoleic acid等与胆汁酸代谢相关的代谢产物和磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂等与脂质相关代谢产物。

图3 NAFLD患者经运动饮食干预前后的差异代谢物热图

2.6 差异代谢产物通路富集分析 利用KEGG通路分析NAFLD生活方式干预前后的血清差异代谢物所富集的通路，结果发现这些差异代谢途径富集于不饱和脂肪酸、胆汁酸合成和苯丙氨酸代谢等(图4)。

图4 差异代谢产物通路富集分析

3 讨论

众所周知，肥胖、富含饱和脂肪和果糖的高热量膳食结构，以及久坐少动的生活方式是NAFLD的高危因素。大量文献[13-15]报道，对于超重、肥胖，以及近期体质量增加和“隐性肥胖”的NAFLD患者，建议通过健康饮食和加强锻炼的生活方式纠正不良行为。本研究发现，经过4周的生活方式干预，NAFLD患者体质量、BMI、ALP、Alb、GGT、ALT、TG都有较大幅度的降低，这与目前的文献报道一致。

随着高通量测序工具-代谢组学已应用于临床疾病的诊断和机制研究中，其已成为中医药领域研究的重要工具，可实现对机体内代谢产物进行快速鉴定分析、寻找差异的生物代谢途径，从而发现疾病的诊断标志物和药物治疗干预的靶向代谢产物[16-17]。近年来，研究[18]表明胆汁酸代谢在肝脏代谢性疾病的发生发展中有着越来越重要的作用，成为诊断肝功能及肝脏疾病的一类敏感的标志物。胆汁酸具有调控胆固醇代谢、促进脂类代谢、增加胆汁分泌等多种作用，是胆固醇代谢过程中的主要代谢产物[19]。初级胆汁酸是肝细胞以胆固醇为原料直接合成的，其从肝内被分泌出来后进入肠腔，在一些酶和细菌的代谢下成为次级胆汁酸[18]。牛磺胆酸是疏水性胆汁酸，亦是初级胆汁酸。有研究[19]表明，肝病患者中的牛磺胆酸水平显著升高，是肝硬化患者中改变最明显的胆汁酸。本研究发现，对NAFLD进行生活方式干预后，与胆汁酸代谢信号通路相关的代谢物出现了显著性改变，提示这些差异的胆汁酸代谢物参与了NAFLD发病过程，生活方式干预后可明显改善胆汁酸代谢紊乱的过程。

肝脏还是氨基酸代谢的主要器官，当肝脏受损时，血液中的氨基酸水平会发生显著变化。本研究发现NAFLD患者血清中酪氨酸水平降低，苯丙氨酸水平显著升高，而经生活方式干预后缓解。这可能是由于运动饮食激活了苯丙氨酸羟化酶的活性，使苯丙氨酸可以顺利转化为酪氨酸，而后者具有清除自由基[20]和减轻炎症的作用[21]。

本研究还发现生活方式干预前后不饱和脂肪酸水平有显著变化，特别是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)水平在干预后显著降低。AA是一种多不饱和脂肪酸，在血液、肝脏等器官中起重要作用。此外，AA还是前列腺素E2、前列腺环素和白细胞三烯的直接前体。这些物质对机体的炎症具有重要的调节作用。有文献[22-23]表明过多的AA堆积会产生大量炎症因子，进一步诱导肝损伤。

本研究还存在着一定的不足之处，比如生活方式干预的时间较短，只有1个月的干预时间，对于有些患病较久的患者而言可能效果并不是非常显著，且由于研究条件的限制，无法百分百监测纳入者有无额外摄入食物，也无法全程监测患者的运动方式是否百分百达标，但是，笔者发现生活方式干预后可以不同程度的改善患者的体质量、肝功能以及血脂，并通过代谢组学更加深入的表明生活方式的干预对患者的代谢起到干预作用，也进一步证实了控制饮食、适当合理的运动对NAFLD患者的重要性和必要性。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：蒋元烨、胡诚负责课题设计；李美莺负责撰写论文；李美莺、汪涛、杜晟楠、高静静参与收集数据；纪万里、刘王振祖负责资料分析；蒋元烨、胡诚负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。