达格列净对糖尿病小鼠肾保护作用及机制研究

杨秋旻， 李佳荫， 张 艳， 闫承慧， 仲崇斌

1.东北大学 生命科学与健康学院，辽宁 沈阳 110167；2.北部战区总医院 心血管内科，辽宁 沈阳 110016

糖尿病是日益严重的公共健康问题。2019年，全球近5亿人患有糖尿病。预计至2045年，全球患有糖尿病的数将增加至7亿人。Ⅱ型糖尿病是最常见的糖尿病类型之一，约占全球现患糖尿病总人数的90%[1]。慢性低度炎症是公认的Ⅱ型糖尿病及其相关并发症的关键特征[2]。达格列净(dapagliflozin，DAPA)是一种新型糖尿病治疗药物，是钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂，能够抑制肾小管S1/S2段SGLT2的表达，从而增加尿糖，降低血糖[3]。有研究表明，DAPA具有独立于血糖控制的心肾保护作用，但其机制不清[4-5]。NF-κB转录因子是产生多种炎性细胞因子的关键成分，也是细胞因子触发效应的中心介质。目前，NF-κB转录因子家族有5位成员：RelA(P65)、RelB、Rel(c-Rel)、P50和P52。除RelB仅能与P52或P50结合形成异二聚体外，其他NF-κB亚基均可两两结合形成同二聚体或异二聚体，其中，P50和P65形成的异二聚体是最常见的形式之一[6]。NF-κB被多种刺激物激活，其磷酸化在刺激物下游的NF-κB活化中起关键作用，NF-κB亚基的磷酸化可能会增强或下调靶基因的转录，或调节转录反应[7]。本研究利用leptin基因敲除的(db/db)小鼠模型建立早期糖尿病肾损伤模型，给予口服DAPA治疗，旨在探讨DAPA对糖尿病肾的保护作用及机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 选取10只8周龄SPF级db/db雄性糖尿病小鼠(购自中国南京模式动物中心)为研究对象。12 h明/暗交替规律照明喂养，温度20℃～25℃，湿度40%～60%。DAPA购自阿斯利康公司。血糖仪及血糖试纸选自美国强生公司。Masson染色试剂盒选自美国SIGMA公司(HT-15-1KT)。PAS染色试剂盒选自北京索莱宝科技有限公司。抗体购自Cell Signaling Technology公司。

1.2 研究方法

1.2.1 实验分组 将小鼠随机分为糖尿病组(DM组)与DAPA组，每组各5只。DM组连续口服喂养水12周；DAPA组连续口服喂养DAPA 12周，期间每周测量小鼠体质量，每2周尾静脉取血测量小鼠的空腹血糖。

1.2.2 实验取材 12周后处死小鼠，留取血清，取肾组织称质量。一个肾组织采用多聚甲醛固定，进行HE染色、Masson染色、PAS染色，观察小鼠肾组织结构变化；另一个肾组织-80℃保存，用于后续蛋白免疫印迹法检测。

1.3 血清学检测小鼠肾功能 采用小鼠血清尿素氮试剂盒(南京建成生物公司研究所)检测小鼠血清中尿素氮的表达水平。

1.4 肾组织形态学观察 肾组织石蜡切片，脱蜡后，经HE染色观察肾组织形态，Masson染色观察肾组织的纤维化水平，PAS染色观察肾组织肾小球硬化情况。

1.5 免疫组织化学染色 肾组织石蜡切片，脱蜡后，于抗原稀释液(抗原稀释液:蒸馏水为1∶50)中煮沸40 min，密闭冷却至室温后，加1滴或50 μl过氧化酶阻断液，室温10 min，PBS洗3次，加1滴或50 μl非免疫动物血清室温10～30 min，除去血清，不清洗切片，加1滴或50 μl一抗(现用现配，一抗∶PBS为1∶100)4℃过夜，复温30 min，PBS洗3次，每次3 min，加50 μl二抗室温1 h，PBS洗3次，每次3 min，加50 μl链霉素抗生物素-过氧化酶溶液室温10 min，PBS洗3次，每次3 min，DAB显色液(现用现配)3～10 min，镜下观察颜色效果，流水冲洗终止反应，HE复染10 min，水洗，75%乙醇-盐酸分化30 s，水洗，氨水反蓝1～2 min，水洗，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.6 AD293细胞培养及体外模型构建 体外应用H2O2刺激AD293细胞，模拟糖尿病小鼠体内由氧化应激引起的炎症。细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM中，静置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，细胞传代至六孔板，在细胞密度为80%左右加入0.8 μmol/L的DAPA，预处理细胞24 h，然后加入H2O20.88 μmol/L处理细胞8 h，分为正常对照组(Con组)，H2O2组，H2O2+DAPA 0.4 μmol/L组，H2O2+DAPA 0.8 μmol/L组。

1.7 蛋白免疫印迹法 取肾组织加入RIPA裂解液研磨机破碎组织，冰上裂解30 min后，4℃、12 000 r/min离心15 min。收集AD293细胞，加入RIPA裂解液混匀，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min离心15 min。收集上清，BCA蛋白定量法检测蛋白浓度，制备蛋白上样样品，组织蛋白于100℃水浴锅中水煮10 min，细胞蛋白水煮5 min；经过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样品，根据所需分子量停止电泳；于转膜液中湿转2 h，转膜结束后，取出PVDF膜于5%脱脂牛奶中室温摇床封闭1 h；将封闭好的PVDF膜置于适当稀释的一抗中，放置于4℃冰箱中孵育过夜，回收一抗，TBST洗膜3次，每次5 min，将PVCF膜放置于稀释好的二抗中，室温摇床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min；将PVDF膜放置于ECL发光液中，然后将膜放入凝胶成像仪中扫描成像并保存图片。应用Image J软件对蛋白条带进行定量分析。

2 结果

2.1 两组小鼠血糖及体质量变化情况比较 12周后，DAPA组小鼠空腹血糖低于DM组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组小鼠体质量比较，差异无有统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 两组小鼠血糖及体质量变化情况比较

2.2 组织染色结果 与DM组小鼠相比，DAPA组小鼠的肾结构比较完整，肾小球内细胞数目有所增加，但未减小肾小球体积大小；DAPA组的肾小球的硬化程度以及肾小球纤维化的现象有所缓解。见图2。

图2 小鼠肾染色结果(a.DM组HE染色，1×；b.DAPA组HE染色，1×；c.DM组PAS染色，40×；d.DAPA组PAS染色，40×；e.DM组HE染色40×；f.DAPA组HE染色，40×；g.DM组Masson染色，40×；h.DAPA组Masson染色，40×)

2.3 两组小鼠肾功能比较 与DM组比较，DAPA组小鼠血清尿素氮水平降低，肾质量及肾质量/体质量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 两组小鼠肾功能比较

2.4 DAPA对小鼠肾SGLT2表达的影响 与DM组比较，DAPA组小鼠肾组织中SGLT2表达量降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图4、图5。

图4 小鼠肾SGLT2免疫组化结果(a.DM组；b.DAPA组)

图5 蛋白免疫印迹法

2.5 DAPA对小鼠肾组织炎症的影响 与DM组比较，DAPA组小鼠肾组织肾小球内CD68表达降低。见图6。蛋白免疫印迹法结果显示，DAPA组小鼠肾组织中P-P65(Ser-468)蛋白表达低于DM组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图7。

图6 小鼠肾CD68免疫组化结果(a.DM组；b.DAPA组)

图7 蛋白免疫印迹法检测小鼠肾炎症因子表达

2.6 DAPA对H2O2刺激AD293细胞炎症反应影响 与Con组比较，H2O2组AD293细胞中SGLT2、P-P65(Ser-468)、P-P65(Ser-536)蛋白表达水平明显升高；与H2O2组比较，H2O2+DAPA 0.4 μmol/L组、H2O2+DAPA 0.8 μmol/L组AD293细胞中SGLT2、P-P65(Ser-468)、P-P65(Ser-536)的蛋白表达明显降低，且H2O2+DAPA 0.8 μmol/L组低于H2O2+DAPA 0.4 μmol/L组。见图8。

图8 蛋白免疫印迹法检测AD293细胞炎症因子表达

3 讨论

《中国Ⅱ型糖尿病防治指南(2020版)》显示，我国成人的糖尿病患病率上升至11.2%，指南推荐有慢性肾病的Ⅱ型糖尿病患者，无论糖化血红蛋白是否达标，若无禁忌证，均应该在二甲双胍的基础上使用SGLT2抑制剂[8]。目前，越来越多的证据支持炎症在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病中的作用[9]。Rangan等[10]对NF-κB亚型在慢性炎症的发病机制和慢性肾病相关细胞存活中的核心作用进行综述。Terami等[11]研究报道，DAPA治疗可显著降低巨噬细胞浸润，以及db/db小鼠肾炎症及氧化应激的表达。Tang等[12]研究报道，DAPA可以降低P65和MCP-1，通过改善高血糖引起的组织炎症和氧化应激进而缓解糖尿病相关肾小球硬化和纤维化进展。有研究报道，DAPA的肾保护作用可能是通过HMGB1-RAGE-NF-κB信号通路介导[13]。以上研究结果提示，在糖尿病中，肾组织的炎症反应增强，而该反应可能由氧化应激导致，DAPA可能通过NF-κB信号通路影响炎症反应，达到糖尿病肾保护作用的效果。

本研究对DAPA喂养12周后的小鼠肾组织进行病理检测，结果发现，DAPA组小鼠的肾小球硬化和纤维化水平明显降低；同时，DAPA组小鼠的空腹血糖和血清尿素氮与DM组小鼠相比显著降低，表明DAPA可以降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平，并且对糖尿病小鼠的肾功能具有一定的保护作用；进一步应用CD68免疫组化染色证实，喂养DAPA 12周后，糖尿病小鼠的肾小球中CD68表达显著降低，提示达格列净可能是通过降低肾组织炎症进行肾功能保护。

NF-κB翻译后修饰，尤其是磷酸化，对NF-κB调节基因转录同样重要[14]。P65存在多种磷酸化位点，NF-κB P65亚基特异性磷酸化导致下游基因选择性转录。在炎症期间，Ser-536和Ser-468磷酸化刺激转录活性[15]。其中，Ser-468磷酸化调节P65的稳定性，Ser-536磷酸化调节亚细胞的定位[14]。体外培养的AD293细胞模型中，DAPA可以降低P65亚基Ser-536和Ser-468位点磷酸化。本研究采用蛋白免疫印迹法检测小鼠肾组织中P-P65(Ser-468)、P-P65(Ser-536)的磷酸化水平，结果显示，DAPA组小鼠肾组织中P-P65(Ser-468)、P-P65(Ser-536)蛋白表达低于DM组，提示DAPA可以显著降低糖尿病小鼠肾组织中P65亚基Ser-536和Ser-468位点的磷酸化，降低糖尿病小鼠肾中炎症因子的表达。

综上所述，DAPA可能通过影响NF-κB信号通路中P65亚基的磷酸化调控下游炎症因子的表达，从而发挥一定的肾保护作用。