镉污染对2种豆科植物叶绿素荧光特性的影响

卫丹丹，王丙全，戴 丽

（1.忻州师范学院，山西忻州034000；2.山西农业大学玉米研究所，山西忻州034000）

镉被广泛应用于电镀工业、电子业、化工业等领域，但是由于工业“三废”的不合理排放，造成镉蓄积于工厂周围的土壤中以及含镉工业废水在农业生产中广泛使用，使土壤受到镉污染[1-2]。重金属镉由于不能被降解，将长期存在于土壤中，造成土壤镉污染，对植物光合系统具有破坏性，其中，光系统Ⅱ（PSⅡ）是比较敏感的部位[3]。逆境胁迫下，叶绿素自发荧光的变化可以反映叶片叶绿素吸收光能的去路变化，即PSⅡ的反应中心光能转化和电子传递的变化情况。

绿豆也称青小豆，为豆科植物，属喜温作物[4]，是一种被广泛种植的杂粮作物，山西为其主产区之一。其蛋白含量高、脂肪含量低，经济价值很高[5-6]。赤豆也称为红小豆，为1年生豆科作物，喜温、喜光、抗涝，其主要含有蛋白质、糖类等营养成分[7-8]。有研究表明[9]，土壤被重金属镉污染后，平邑甜茶根系细胞膜质子泵的活性被抑制，根系从土壤中吸收营养元素的动力下降。植物遭受重金属镉胁迫后，活性氧（ROS）大量产生，细胞膜脂过氧化，甚至引起细胞早衰，导致植物萎蔫死亡[10]。镉胁迫不仅会改变细胞膜脂的构成，影响养分吸收，而且还会对不同基因型甘蓝幼苗叶片的光合作用产生严重抑制[11]。植物叶片PSⅡ反应中心是将光能转换为电能的重要部位，它的活性大小直接影响着光能转换效率的高低。植物叶片的叶绿素荧光特性可以快速反映PSⅡ反应中心、电子供体侧和受体侧的功能变化[9，12]。有研究发现[13-14]，低温、盐碱胁迫等外界环境因素的变化会严重降低植物PSⅡ的活性，土壤重金属镉、铅污染也会破坏杨树和玉米叶片的PSⅡ光系统的结构[3，15]。前人研究结果表明[16]，重金属镉胁迫对绿豆幼苗的生物量、光合作用、微量元素积累等方面都会产生很大的影响，但其具体伤害机制尚未有研究报道。

本研究以2种豆科植物毛绿一号绿豆和大红袍赤豆为试验材料，通过测定不同浓度CdCl2处理后绿豆和赤豆幼苗叶片叶绿素荧光诱导动力学曲线和相应参数的变化，分析CdCl2处理对这2种豆科植物光合机构PSⅡ反应中心、电子传递的影响，旨在为进一步揭示豆科植物光合机构镉伤害机制提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试绿豆品种为毛绿一号绿豆种子，是一种早熟高产抗病性好的春播品种，购自北京中农金科种业科技有限公司；供试赤豆品种为大红袍赤豆种子，由山西农业大学玉米研究所提供。

1.2 试验方法

试验于2019年在忻州师范学院实验室完成。分别选取大小一致的毛绿一号绿豆种子和大红袍赤豆种子，经水浸泡24 h后播种在装有石英砂的花盆中（高10 cm，长8 cm，宽8 cm），每个品种播种15盆，每盆播种5颗种子；每天浇灌等量的Hoagland营养液，30 d后，对2种豆科植物绿豆和赤豆开始进行外源镉胁迫处理；每天用等体积的不同浓度CdCl2溶液浇灌1月龄的2种豆科植物幼苗，CdCl2溶液的质量浓度分别设置为0（CK）、0.2、0.5、1.0、5.0 mg/L，每处理5株，重复3次。不同质量浓度CdCl2溶液用1/2 Hoagland营养液进行配制，CK为等量的1/2 Hoagland营养液。于每天9：00测定毛绿一号绿豆和大红袍赤豆幼苗叶片的叶绿素荧光参数，直到幼苗出现明显的表型特征。镉胁迫处理10 d后，剪下0.5 g幼苗叶片，进行超氧阴离子（O2·-）和H2O2检测。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 超氧阴离子（O2·-）检测和H2O2检测 叶片超氧阴离子（O2·-）释放速率测定参考ELSTNER等[17]的方法进行；叶片H2O2含量的测定参照ELSTNER等[17]的方法进行；叶片H2O2含量的测定参照MUKHERJEE等[18]的方法进行。

1.3.2 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的测定2种豆科植物叶绿素荧光动力学曲线的测定参考李鹏民[13]的方法进行。自下往上选择毛绿一号绿豆和大红袍赤豆幼苗植株的第2片真叶（避开叶脉），用叶夹夹住叶片，暗适应25 min；之后在饱和脉冲光（3 500 μmol/（m2·s））下暴露1 s，用便携式叶绿素荧光仪Pocket-PEA测定毛绿一号和大红袍幼苗叶片的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线，即O-J-I-P曲线。并对所测得的各荧光参数进行JIP-test分析[19]。

式中，Fv/Fm为最大光化学效率，Fo为最小荧光，是荧光诱导动力学曲线O相（50 μs）的荧光强度；Fm为最大荧光，是荧光曲线P相（0.3～1.0 s）所对应的荧光强度；Fv为最大可变荧光。

式中，Vt为t时间时的相对可变荧光，Ft为t时间的荧光强度。在K相（300 μs）、J相（2 ms）、I相（30 ms）的相对可变荧光分别为VK、VJ、VI。

式中，φEo为用于电子传递的量子产额，φPo表示最大光化学效率；Ψo表示电子传递到QA-下游电子受体的概率（1－VJ）。

式中，PIabs为光合性能指数，RC/ABS表示以光能吸收为基础的反应中心数量。

式中，Wk为在K点的可变荧光FK占FJ－Fo振幅的比例，FJ为J点的荧光强度，Sm为直线F＝Fm和P相之间的标准化的互补面积，Area为直线F＝Fm和J－P相之间的面积。

1.4 数据统计

采用Excel 2010、SigmaPlot 12.5和SPSS Statistics 22.0软件对数据进行处理和统计学分析。

2 结果与分析

2.1 超氧阴离子（O2·-）和H2O2检测分析

CdCl2胁迫会增加植物体内的活性氧（ROS）的含量，引起氧化胁迫，在光照条件下，叶绿素光合系统中的线性电子传递链通常是ROS产生的主要来源，O2·-和H2O2是ROS的2种主要形式。由图1可知，CdCl2处理会引起O2·-和H2O2在叶片中大量积累，且随着CdCl2浓度的增加，活性氧在幼苗叶片中的积累增加；在0.5、1.0、5.0 mg/L的CdCl2处理下，毛绿一号和大红袍叶片中O2·-和H2O2的积累量显著大于CK（0 mg/L）。

2.2 CdCl2处理下绿豆和赤豆幼苗叶片叶绿素荧光诱导动力学曲线

不同浓度的CdCl2对毛绿一号和大红袍处理10 d后，利用便携式叶绿素荧光仪Pocket-PEA获得镉胁迫后2种豆科植物叶片的叶绿素荧光变化情况，绘制毛绿一号和大红袍的叶绿素荧光诱导动力学曲线（O-J-I-P曲线，图2），不同浓度CdCl2胁迫后，2种豆科植物的OJIP曲线形状都发生了一定的改变。毛绿一号幼苗在50 μs的荧光强度（Fo）和300 μs的荧光强度（FK）随着CdCl2处理浓度的增加而逐渐增加，2 ms的荧光强度（FJ，J点）和30 ms的荧光强度（FI，I点）及P相的荧光强度（Fm，P点）则随胁迫浓度增加而逐渐减小；大红袍的最小荧光（Fo）则没有明显变化，且随CdCl2质量浓度升高，I点和P点荧光强度下降。

2.3 CdCl2处理对叶绿素荧光动力学参数的影响

2.3.1 CdCl2处理对PIabs、Fv/Fm（φPo）、Fv/Fo、Ψo、φEo和Sm的影响 不同浓度CdCl2胁迫使2种豆科植物幼苗的各荧光参数呈规律性的变化。大红袍赤豆的光合性能指数PIabs随CdCl2质量浓度的增加而显著减小，0.5 mg/L的CdCl2胁迫就能显著降低赤豆叶片的光合能力，而镉对毛绿一号光合能力的伤害比大红袍小，5 mg/L的CdCl2才对PIabs造成显著影响（图3）。叶片的最大光化学效率Fv/Fm反映光系统Ⅱ（PSⅡ）的最大活性，但是Fv/Fm参数对镉胁迫不敏感；Fv/Fo是反映PSⅡ反应中心光能潜在活性的指标。从图3可以看出，不同浓度的CdCl2处理后，大红袍的荧光参数Fv/Fo随Cd浓度增加而显著下降，0.2、0.5、1.0、5.0 mg/L的CdCl2处理的毛绿一号分别比CK降低20.27%、29.67%、30.78%、34.71%；大红袍分别比CK降低29.73%、37.18%、44.83%、47.35%，大红袍Fv/Fo降低的程度比毛绿一号Fv/Fo大，说明Cd胁迫对大红袍赤豆PSⅡ反应中心的伤害比毛绿一号绿豆大。镉处理后，2种豆科植物的Ψo、φEo值都下降，且0.2 mg/L的CdCl2对大红袍的电子传递链造成极大伤害，此时光合系统中进入电子传递的能量减少；而镉胁迫对毛绿一号电子传递的伤害比赤豆小，在5 mg/L的CdCl2处理时才会有显著伤害。随处理浓度增大，PSⅡ受体侧的电子传递体（Sm）减少。以上结果表明，镉污染越严重，豆科植物毛绿一号绿豆和大红袍赤豆PSⅡ的潜在活性下降越大，且镉污染对大红袍PSⅡ反应中心的伤害比对绿豆大。

2.3.2 CdCl2处理对PSⅡ电子供体侧、受体侧和PQ库的影响OJIP曲线中K点的变化可以反映PSⅡ电子供体侧放氧复合体（OEC）的变化情况。VJ的升高表示PSⅡ电子传递链中QA到QB的传递发生改变[20]。随着CdCl2处理浓度增大，毛绿一号和大红袍的Wk值呈增大的趋势，且赤豆的Wk大于绿豆的Wk，说明镉胁迫下，这2种豆科植物的放氧复合体都发生损伤，且大红袍的放氧复合体受损伤更严重。镉胁迫后，VJ的升高表示PSⅡ上的电子不能从QA传递到QB，赤豆的VJ显著升高，而毛绿一号的VJ变化则不明显，说明镉胁迫阻断了大红袍的线性电子传递，且这种阻断程度随镉胁迫浓度增加而增大。VI的升高表示PQ库出现了异质化，2种豆科植物的VI都呈升高趋势，且显著高于CK，说明2种豆科植物的PQ库都发生明显异质化（图4）。由以上结果可知，镉胁迫同时伤害大红袍PSⅡ电子的供体侧和受体侧，对毛绿一号的电子供体侧也有很大伤害，而对其受体侧影响较小。

2.3.3 CdCl2处理对PSⅡ反应中心能量分配的影响JIP-test分析[19]中，单位面积光能吸收（ABS/CSm）。有活性的反应中心的密度（RC/CSm）、热耗散掉的能量（DIo/CSm）及捕获（TRo/CSm）、用于电子传递的能量（ETo/CSm）等反映PSⅡ能量分配的参数也能被检测。

由图5可知，镉胁迫对2种豆科植物绿豆和赤 豆ABS/CSm并没有显著的影响，而不同浓度的CdCl2处理对毛绿一号和大红袍幼苗叶片ETo/CSm、DIo/CSm和RC/CSm有一定差异。随着CdCl2处理浓度的增加，毛绿一号和大红袍叶片ETo/CSm和RC/CSm呈下降趋势，且处理浓度越大处理时间越长，其下降幅度越大；而DIo/CSm随处理浓度增大而升高。CdCl2处理10 d后，0.2、0.5、1.0、5.0 mg/L的CdCl2处理绿豆的ETo/CSm分别比处理前降低6.73%、17.36%、28.03%、39.13%；而大红袍分别比处理前降低24.24%、37.81%、47.20%、59.36%。0.2、0.5、1.0、5.0 mg/L的CdCl2处理毛绿一号的DIo/CSm分别比处理前增加10.32%、16.25%、21.32%、29.55%；而大红袍分别比处理前增加27.85%、46.08%、61.14%、76.65%。RC/CSm随着CdCl2处理浓度的增加而下降，其中，0.2、0.5、1.0、5.0 mg/L的CdCl2处理绿豆的RC/CSm分别比处理前降低29.67%、38.49%、43.21%、52.19%；而大红袍分别比处理前降低36.47%、45.72%、52.35%、59.14%。由此可知，在同一浓度下，处理相同时间的毛绿一号和大红袍幼苗，毛绿一号幼苗叶片荧光参数ETo/CSm、DIo/CSm、RC/Sm的变化程度比大红袍幼苗小，说明镉胁迫虽然不影响毛绿一号和大红袍单位叶面积能量的吸收，但是与CK相比，镉胁迫显著影响进入电子传递的能量，降低有活性的反应中心数量，说明镉污染破坏了豆科植物毛绿一号绿豆和大红袍赤豆的反应中心，影响PSⅡ的能量分配方式。

3 结论与讨论

土壤镉污染会影响植物种子萌发[21]和植株生长。有研究表明，低剂量镉能促进蓖麻植株生长，而高剂量则对会对其产生抑制作用[22]。为了研究土壤中重金属镉的积累对豆科植物光合机构的影响，本试验对2种豆科植物毛绿一号绿豆和大红袍赤豆幼苗叶片的叶绿素荧光动力学曲线进行了JIP-test分析，结果表明，绿豆和赤豆的PIabs、Fv/Fo、Ψo、φEo等均随着CdCl2胁迫浓度的增加而呈下降趋势。PIabs是光合性能指数，其大小可以反映叶片的光合能力。CdCl2胁迫导致叶片的PIabs下降，降低毛绿一号绿豆和大红袍赤豆的光合能力，这与油菜的光合机构对重金属镉胁迫的响应一致[23]。但是这2种豆科植物光合能力下降程度却不同，大红袍的光合能力强于毛绿一号，但是毛绿一号对重金属镉的抗性却比大红袍强。研究镉对大红袍赤豆光合能力造成伤害的原因有助于农业生产中提高赤豆的抗镉能力及其为分子育种提供理论依据。

镉污染对不同植物的影响不同，斑茅可以很好地吸收、转移累积镉，其可以作为镉污染土壤的修复植物[24]。但是镉对甘薯的生长却有伤害，生长于镉污染土壤中的甘薯植株，镉在根中的积累量大于叶片[25]。Cd离子积累不仅会引起蜀葵和二月兰根芽损伤，而且还会抑制叶片的光合作用和蒸腾作用[26]。本研究中，CdCl2胁迫破坏豆科植物光合机构，导致其光合能力下降。光系统II（PSⅡ）的最大光化学效率Fv/Fm（φPo）是对CdCl2影响最不敏感的参数，毛绿一号与大红袍的Fv/Fm并没有差异，且随着CdCl2浓度增加，Fv/Fm的下降并不明显。2005年，JANECZKO等[23]对油菜幼苗的研究表明，镉似乎不会影响光合色素的含量，油菜幼苗被Cd胁迫14 d后，类胡萝卜素、叶绿素a和叶绿素b的含量没有显著变化。色素是光能吸收的主要来源，在本研究中，毛绿一号绿豆和大红袍赤豆在镉胁迫前后单位面积光能的吸收量（ABS/CSm）并无显著差异，也表明Cd胁迫对植物叶片的光合色素不造成伤害。

Cd胁迫会导致受体侧捕光色素复合体Ⅱ（LHCⅡ）解离，从而导致电子传递紊乱[27]。在本研究中，镉对大红袍叶片PSⅡ电子传递的能量分配造成很大影响。随着CdCl2浓度的增大，大红袍幼苗叶片PSⅡ的电子供体侧和受体侧都受到严重伤害，放氧复合体（OEC）发生损伤，电子从QA传递到QB的传递产生破坏，同时PSⅡ受体侧传递体减少，QA-积累增加，受体侧的电子传递能力下降，这些都是镉胁迫下赤豆PSⅡ电子传递能力下降的原因。但是镉对毛绿一号的伤害仅限于电子的供体侧，即放氧复合体（OEC），而对其电子受体侧伤害较小。

Cd胁迫会引发非光化学淬灭或热耗散的升高。对油菜叶片PSⅡ进行叶绿素荧光分析表明，Cd胁迫下，油菜叶片横截面的PSⅡ有活性的反应中心数量（RC/CSm）、单位叶面积用于电子传递的能量（ETo/CSm）下降，放氧复合体活性也下降[23]。本研究表明，随着CdCl2处理浓度的增加，毛绿一号和大红袍单位面积的光能吸收（ABS/CSm）都没有显著变化，表明镉对这2种豆科植物的光合能量吸收没有产生影响。从不同浓度Cd处理的第2天开始，绿豆的ETo/CSm、RC/CSm下降程度明显大于赤豆，单位面积用于热耗散的能量（DIo/CSm）则增大，说明此时毛绿一号通过增加热耗散、关闭反应中心来提高抗性。由此可见，Cd胁迫降低豆科植物光合机构对光能的转化效率，增加热耗散，影响光合系统线性电子传递链中电子的正常传递，抑制光合作用。

综上所述，0.2～5.0 mg/L的CdCl2处理改变了2种豆科植物毛绿一号绿豆和大红袍赤豆幼苗叶片的叶绿素荧光诱导动力学曲线形状，并且它们叶绿素荧光参数的改变说明镉胁迫使豆科植物赤豆的光合能力下降的主要原因是Cd对大红袍赤豆PSⅡ供体侧、受体侧和反应中心造成伤害，降低PSⅡ活性；而毛绿一号绿豆通过增加热耗散、关闭反应中心，减轻镉对PSⅡ电子受体侧的伤害，从而减轻Cd对其光合能力的影响。