达卡巴嗪长循环脂质体的制备及体内抗肿瘤效应*

王丽 朱九群 龙超 何林 董文娟

(1.南充市中心医院药学部·个体化药物治疗重点实验室，四川 南充 637000； 2.四川省人民医院药学部，四川 成都 610072；3.电子科技大学医学院，四川 成都610072)

恶性黑色素瘤是黑色素细胞恶变而来的肿瘤，恶性程度高。黑色素瘤发现越早，治愈可能性越大，预后越好。90%～95%早期恶性黑色素瘤可以经外科手术治愈，中、晚期手术治疗效果较差，一般建议以内科治疗为主的全身系统治疗[1]。

美国FDA 1975年将达卡巴嗪(dacarbazine,DTIC)批准用于恶黑的化疗[2-6]。长期以来是黑色素瘤化疗的“金标准”，但DTIC在临床使用中存在稳定性差，患者顺应性低，不良反应严重，对脑转移无效等缺陷[9-10]。

脂质体(liposome,LP)目前已成为一种有效的药物递送系统。相比普通剂型，脂质体能改善药物的药代动力学和药效学并降低药物的毒副作用[11-13]。但普通脂质体易被血管和肝脾吞噬细胞迅速吞噬，用聚乙二醇对脂质体进行表面修饰可屏蔽机体网状内皮系统对脂质体的识别，延迟肝脾清除，使药物体内循环时间延长，被称为隐形脂质体(Stealth liposome,SL)，又称为长循环脂质体(long circulating liposome,LCL)[14-18]，还可通过EPR效应自发往肿瘤中聚集，发挥靶向作用[19-20]。本文拟制备PEG修饰的DTIC长循环脂质体(PEG-DTIC-LP)，对其体内的抗肿瘤效应进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 一般材料 N-1200A旋蒸仪购自东京理化器械株式会社；JY92-IIDN超声波细胞破碎机购自宁波新芝生物科技公司；Universal 320R离心机购自德国Hettich公司； Malvern Zetasizer Nano ZS90纳米激光粒度仪购自英国Malvern公司；透射电镜购自美国FEI公司；DTIC购自苏州立新制药有限公司；大豆卵磷脂、胆固醇、硫酸铵购自成都科龙化工试剂厂；DSPE-PEG2000购自上海RVT医药科技公司；B16-F10细胞购自ATCC细胞库。健康SPF级C57BL/6小鼠，六周龄，体重18～22g，雌雄各半，由四川省人民医院实验动物中心提供，实验动物许可证号SYXK(川)2013-110。本试验动物的处理符合动物伦理要求，并经南充市中心医院伦理委员会审核同意。

1.2 方法

1.2.1 PEG-DTIC-LP的制备及性质表征 采用硫酸铵梯度法制备PEG-DTIC-LP[21]。按70∶5∶25摩尔比称取大豆卵磷脂、DSPE-PEG2000、胆固醇装入圆底烧瓶，用适量三氯甲烷充分溶解，于旋蒸仪上旋蒸去掉有机溶剂后在瓶底形成无色透明薄膜，加入0.3 mol/L硫酸铵溶液适量，继续旋蒸形成乳白色混悬液，用超声波细胞破碎机超声5 min即制得空白脂质体。将空白脂质体装于透析袋中，用5% GS溶液透析8 h，每小时换一次透析液。透析完成后将处方量DTIC加入空白脂质体，40 ℃孵育20 min，即得1mg/mL的PEG-DTIC-LP混悬液。

1.2.1.1 包封率和载药量 将PEG-DTIC-LP置于超滤离心管中离心可得游离DTIC溶液，采用紫外分光光度法测定DTIC浓度，按公式1和公式2计算包封率和载药量。

(公式1)

(公式2)

1.2.1.2 外观和形态 肉眼观察PEG-DTIC-LP混悬液的质地、颜色；采用负染法处理样品，用透射电镜观察其微观形态。

1.2.1.3 粒径分布和Zeta电位 采用Malvern Zetasizer Nano ZS90粒度仪测定PEG-DTIC-LP的粒径、分布及Zeta电位。

1.2.1.4 稳定性考察 将新制备的PEG-DTIC-LP混悬液放置于4℃冰箱冷藏，观察其外观变化并逐周测定包封率，考察其载药稳定性。

1.2.1.5 体外释药性 取1 mL PEG-DTIC-LP混悬液于MW3500透析袋中，放置于50 mL 10mmol/L的 PBS 6.5和PBS 7.4透析液中，设置37℃恒温摇床100 r/min持续振摇。分别于时间点1、2、4、8、12、24小时吸取透析液500 μL测定DTIC浓度，每次取液后需补充500 μL对应空白透析液。最后一个时间点取完后将透析袋中的PEG-DTIC-LP混悬液倒入释放介质中，并加入10%Triton X-100溶液50 μL，吸取该混合溶液500 μL测定DTIC浓度。DTIC浓度的测定采用紫外-可见分光光度法，按公式3计算药物累积释放率，绘制体外累积释药曲线图[22-23]。

(公式3)

1.2.2 PEG-DTIC-LP体内抗肿瘤效应研究 将对数生长期B16-F10细胞用无菌生理盐水配制成2×106个/ mL的细胞悬液，于C57BL/6小鼠背部皮下注射0.2 mL B16-F10细胞悬液，精心饲养小鼠10天，筛选肿瘤生长良好的小鼠作为荷黑色素瘤小鼠模型。选出24只肿瘤大小及体重相近(23±2.5g)的荷瘤小鼠，分为生理盐水组、空白脂质体组、DTIC溶液组、PEG-DTIC-LP组4组，每组6只，雌雄各半。于第1、3、5、7、9天按10 mg/kg给药剂量给生理盐水组小鼠尾静脉注射生理盐水，空白脂质体组尾静脉注射空白脂质体混悬液，DTIC溶液组尾静脉注射1mg/mL DTIC溶液，PEG-DTIC-LP组尾静脉注射1 mg/mL PEG-DTIC-LP混悬液。以肿瘤体积、小鼠体重、小鼠存活天数为指标，评价PEG-DTIC-LP的抗肿瘤效应，并与其余各组进行比较。从治疗第一天开始隔天一次测量小鼠肿瘤体积和小鼠体重。从肿瘤细胞接种日期(day 0)算起，统计小鼠存活天数，绘制各组小鼠的生存曲线图。

2 结果

2.1 PEG-DTIC-LP性质表征

2.1.1 包封率和载药量 硫酸铵梯度法制备的PEG-DTIC-LP包封率为(60.41±2.47)%，载药量为(5.95±0.24)%。

2.1.2 外观及形态 肉眼观察下PEG-DTIC-LP混悬液呈质地均匀、半透明、有亮蓝光泽的乳白液体。在透射电镜下呈球形，外观圆整，见图1。

图1 PEG-DTIC-LP透射电镜图

2.1.3 粒径分布及Zeta电位 Malvern Zetasizer Nano ZS90粒度仪测得PEG-DTIC-LP的粒径呈近似正态分布，平均粒径为190nm，多分散指数(polydispersity index，PDI)为0.184，Zeta电位-53.8 mV，见图2。

图2 PEG-DTIC-LP粒径分布直方图

2.1.4 稳定性考察 4℃条件下，7天内PEG-DTIC-LP混悬液的外观无明显变化；放置14天后，亮蓝色乳光消失。28天包封率变化为：0天(60.41±2.47)%、7天(59.15±0.98)%、14天(55.66±0.69)%、21天(51.03±2.09)%、28天(33.10±0.29)%，可见放置7天后PEG-DTIC-LP包封率无显著变化(P>0.05)，由60.41%下降为59.15%，放置14天后包封率下降为(55.66±0.69)%(P<0.05)。

2.1.5 体外释放研究 PEG-DTIC-LP在PBS 6.5和PBS 7.4中的药物累积释放曲线，PEG-DTIC-LP在两种释放介质中均呈现一定缓释特性，在弱酸性环境PBS6.5中呈现出更高的药物释放率，见图3。

图3 达卡巴嗪长循环脂质体体外释药曲线图

2.2 PEG-DTIC-LP体内抗肿瘤效应

2.2.1 各组荷瘤小鼠肿瘤体积变化比较 给药后第18天，PEG-DTIC-LP组小鼠肿瘤体积为(696.63±536.82)mm3，显著小于DTIC溶液组(5128.93±1120.49)mm3和生理盐水组(3174.46±1160.98) mm3(P<0.05)，小于空白脂质体组(1771.39±909.04 )mm3，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

图4 荷瘤小鼠肿瘤体积变化

2.2.2 各组荷瘤小鼠给药后体重变化 空白脂质体组、生理盐水组和DTIC溶液组的荷瘤小鼠给药后体重变化曲线基本重合，三组比较差异无统计学意义(P>0.05)。PEG-DTIC-LP组荷瘤小鼠平均体重低于其余三组(P<0.05)，原因可能是该组小鼠给药后黑色素瘤生长速度显著减小，使瘤体重量小于其余各组，见图5。

图5 荷瘤小鼠体重变化

2.2.3 荷瘤小鼠生存时间 各组荷瘤小鼠中位生存时间长短分别为：PEG-DTIC-LP组为35天，DTIC溶液组为26天，空白脂质体组为31天，生理盐水组为29天，即PEG-DTIC-LP组>空白脂质体组>生理盐水组>DTIC溶液组(P<0.05)，见图6。

图6 荷瘤小鼠生存曲线图

3 讨论

本实验制备的PEG-DTIC-LP平均粒径为190nm，研究表明[24]粒径小于200nm，有利于脂质体进入血管内皮细胞间隙，渗透进入病灶组织发挥药效。

体内药效学实验结果显示，PEG-DTIC-LP组荷瘤小鼠给药后肿瘤体积最小，中位生存时间最长，初步证明PEG-DTIC-LP疗效显著优于DTIC溶液。但令人意外的是，相比生理盐水和空白脂质体两个空白对照组，DTIC溶液组小鼠中位生存时间最短，肿瘤体积最大，造成该结果原因可能有三点：①小鼠样本量偏少。本来实验最初预定的是每组10只小鼠，由于构建黑色素肿瘤模型过程中，部分小鼠建模失败和死亡，最终筛选出建模成功、体重和肿瘤大小接近的荷瘤小鼠24只，每组6只，造成实验样本量小，实验结果误差偏倚较大，这是本实验的遗憾和不足。②普通DTIC制剂自身有效率偏低，1998-2006年4个Ⅲ期多中心随机对照研究显示DTIC单药有效率仅为7.5%～12.2%[25]。③DTIC游离药物细胞毒作用强，使小鼠给药后存活时间较短。

4 结论

本实验研究结果提示，将DTIC制备成长循环脂质体有利于提高其抗肿瘤效应。