蔗糖为原料同步糖化发酵生产乳酸单体

张桦宇，田康明，赵继华，牛丹丹，MCHUNU Nokuthula Peace，王正祥,*

(1天津科技大学生物工程学院，天津300457；2天津科技大学化工与材料学院，天津300457；3Biotechnology Platform, Agricultural Research Council, Pretoria South Africa 0001)

0 引言

甘蔗是世界上生物量最大的栽培作物，是蔗糖生产的主要来源，也是我国重要的经济农作物[1]。蔗糖作为甘蔗的主要产物，一直以来都是我国重要的生活物资和战略储备物资。随着社会进步与我国淀粉糖产业的迅猛发展，近年来蔗糖消费结构与蔗糖作为工业原料的应用领域出现了重大改变。需要拓宽以蔗糖为大宗工业原料规模化生产其他大宗工业品的生产技术。现有以蔗糖或糖蜜生产活性干酵母和燃料乙醇，可以将蔗糖就地实现大规模生物转化，但是经济效益有待进一步提高[2-3]。因此，寻求更大规模的、商业价值更显著的其他大宗工业品或平台化合物，可以更好地提升甘蔗种植业与甘蔗产业的经济效益与社会效益。

近年来，随着“白色污染”治理需求，生物可降解聚乳酸材料发展迎来巨量市场需求。聚乳酸生产所需乳酸单体的大规模工业化生产，已成为聚乳酸产业链中最为关键的一环[4-6]。前期的研究结果显示，以淀粉或生物柴油副产物甘油为原料，通过代谢工程菌生物代谢已实现乳酸单体(D-型乳酸或L-型乳酸)的规模化生产[7-9]。

进一步寻找乳酸单体生产的大宗发酵原料(如蔗糖)，同样是实现乳酸单体生产与聚乳酸产业链健康平稳发展的重要内容。已有研究结果表明，郭洋等[10]筛选分离出1株米根霉GY18，能够利用高浓度的蔗糖(120 g/L)发酵产L-乳酸114.7 g/L，产酸强度为2.39 g/(L·h)，转化率为95.5%。赵锦芳等[7]利用大肠杆菌HBUT-L，以蔗糖和甘蔗糖蜜发酵产L-乳酸，乳酸浓度为60.0和87.0 g/L，产酸强度分别为0.625和0.389 g/(L·h)，光学纯度均达99%，糖酸转化率分别为74.0%和83.5%。Zhou等[11]以大肠杆菌SZ132利用蔗糖发酵产D-乳酸，乳酸浓度为90 g/L，产酸强度为0.75 g/(L·h)，光学纯度高达99.5%，糖酸转化率为90.0%。Lebaka等[12]利用蔗糖发酵L-乳酸浓度144.2 g/L，产酸强度为3.0 g/(L·h)，糖酸转化率为96.13%。Calabia等[13]利用甘蔗糖蜜和甘蔗汁，产D-乳酸浓度为107和120 g/L，糖酸转化率分别为89.9%和90.2%。由于绝大多数大肠杆菌代谢蔗糖的能力缺失或代谢能力较低，以大肠杆菌重组菌从蔗糖合成乳酸单体的发酵强度与产酸水平有待进一步提升。

本课题组在前期的研究中，已创建了系列乳酸单体高效生产菌种，实现了以葡萄糖或甘油为原料的L-乳酸规模化发酵生产[8-9]。为了实现以蔗糖为原料生产L-乳酸的目标，本文在产L-乳酸重组菌JC31L的基础上[14-15]，试图建立以蔗糖为原料发酵生产L-乳酸的高效新工艺，以实现蔗糖为原料的乳酸单体的高效生产，也为大宗原料蔗糖转化为大宗需求量乳酸单体的工业化生产提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

菌株JC31L，为产L-乳酸重组大肠杆菌，为本实验室前期构建和保藏[14-15]。

1.2 仪器和设备

本研究中所使用的主要仪器和设备具体如表1所示。

表1 主要仪器和设备

1.3 培养基

LB培养基[16]，固体培养基为在LB液体培养基的基础上添加2%琼脂。

M9培养基[16]：十二水磷酸氢二钠15.11 g/L，磷酸二氢钾3 g/L，氯化铵1 g/L，氯化钠0.5 g/L，pH为7.0。接种前加入0.1%硫酸镁溶液(1 mol/L)、0.1%微量元素溶液。葡萄糖、果糖或蔗糖溶液根据需要添加。

1.4 蔗糖酶酶活测定

蔗糖酶的酶活测定，参照GB/T 5009.255-2016中的方法进行[17]。蔗糖酶酶活定义：一个蔗糖酶单位(U)在37℃、pH 6.5条件下，每分钟水解产生1 μmol葡萄糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位。

1.5 不同碳源生长与产酸评价

采用M9培养基制备固体平板，分别添加5 g/L的葡萄糖、果糖和蔗糖作为唯一碳源，同时添加氨苄青霉素100 μg/mL。重组菌由甘油冻藏管划线至M9固体平板，37℃培养15 h，观察菌落生长情况。摇瓶发酵工艺和发酵罐发酵工艺，均采用实验室前期建立的发酵工艺进行[9]。

1.6 蔗糖酶基础酶学性质分析

蔗糖酶酶制剂采购于江苏锐阳生物科技有限公司，酶活单位为70000 U/g。将酶粉用无菌水溶解后，过0.22 µm的微孔滤膜进行除菌，分装后备用。

1.6.1 热稳定性

所试蔗糖酶在30～60℃温度下热处理1 h，并测定其残余酶活，以未经保温处理的酶样酶活为100%来计算各样本的相对酶活，确定酶的热稳定性。

1.6.2 pH稳定性

所试蔗糖酶在pH 3.0～7.5的条件下放置1 h，并测定其残余酶活，以未经放置1 h处理的酶样酶活为100%来计算各样本的相对酶活力，确定酶的pH稳定性。

1.6.3 金属离子对酶活的影响

所试蔗糖酶在5 mmol/L的不同金属离子溶液(Mg2+、Zn2+、Ni+、K+、Mn2+、Ca2+、Li+、Na+或Fe2+)于4℃条件下放置16 h后，测定样本的酶活，以添加等体积缓冲液的酶液酶活为100%来计算各样本的相对酶活力，确定不同金属离子对蔗糖酶酶活的影响。

1.7 同步糖化发酵工艺

1.7.1 蔗糖酶添加量的确定

在37℃、pH 7.0和42℃、pH 7.0的发酵工艺条件下测定蔗糖酶的酶活，并与酶活定义条件下(37℃、pH 6.5)蔗糖酶酶活对比。根据酶活定义条件下蔗糖酶对蔗糖的水解和单糖碳源发酵条件下糖的消耗量，确定蔗糖酶的基础添加量。

1.7.2 同步糖化发酵试验

采用前期建立的变温发酵工艺加以改进进行[9]，以蔗糖替代葡萄糖进行补料发酵。

1.8 分析方法

1.8.1 糖分的测定

⑴葡萄糖浓度测定：将样品适当稀释后使用SBA-40C型生物传感仪进行葡萄糖浓度的测定，取3次平行数据的平均值。

⑵果糖浓度测定：用二硝基水杨酸法(DNS)法[18]测定还原糖的浓度，测定值减去其中的葡萄糖浓度即为样品中果糖的浓度，取3次平行数据的平均值。

⑶蔗糖浓度测定：蔗糖浓度用HPLC方法进行测定[19]。

1.8.2 菌体量测定

菌体量通过分光光度计浊光度法测OD600，然后按照1 OD等于0.38 g/L细胞干重的对应关系进行生物量的换算。

1.8.3 L-乳酸及有机酸的测定

发酵过程采用SBA-40C生物传感仪酶膜法对L-乳酸浓度进行快速测定。所有数据均为3次平行试验结果的平均值。同时采用HPLC对样本中L-乳酸及其他有机酸的准确含量进行测定，色谱检测条件为：色谱柱为HPX-87H有机酸分析柱，柱温为65℃，检测波长为210 nm，流动相为5 mmol/L浓度的硫酸溶液，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL。

1.8.4 L-乳酸光学纯度的测定

采用HPLC进行，色谱检测条件为：色谱柱为Astec CLC-L光学纯度分析柱，柱温为25℃，检测波长为254 nm，流动相为5 mmol/L浓度的硫酸铜溶液，流速为1 mL/min，进样量为10 μL。

2 结果与讨论

2.1 乳酸生产菌的碳源代谢能力

将菌株JC31L分别划线于以5 g/L浓度的葡萄糖、果糖、蔗糖为唯一碳源的M9固体培养基上，37℃培养15 h，观察菌体生长情况，同步分别以葡萄糖、果糖、蔗糖为唯一碳源进行摇瓶发酵，分别测定生物量L-乳酸浓度，结果如图1所示。菌株JC31L在蔗糖为唯一碳源处未长出菌落，而在葡萄糖、果糖碳源处表现出较好的生长特征；在液体培养条件下，菌株同样可以利用葡萄糖或果糖为碳源进行生长、发酵，但不能以蔗糖为碳源进行生长、发酵。可见，L-乳酸生产菌株JC31L不具有直接利用蔗糖的能力。此菌株能够很好代谢葡萄糖和果糖，也从另外一个方面说明，蔗糖被水解为葡萄糖和果糖后，可以作为此菌株的碳源。

图1 出发菌JC31L利用不同碳源的生长和产酸情况

2.2 代谢单糖和转化糖为L-乳酸

在5 L发酵罐中，分别以葡萄糖、果糖和蔗糖酶解后的转化糖为碳源进行产L-乳酸发酵，结果如图2和表2所示。菌株JC31L能高效利用葡萄糖或果糖进行L-乳酸发酵生产；以转化糖为碳源进行发酵生产时，葡萄糖和果糖代谢存在葡萄糖效应，葡 萄糖代谢优先于果糖代谢，当葡萄糖浓度低于10 g/L时葡萄糖效应消除，果糖代谢效率明显恢复。可见，优化转化糖的生成方式和补加方式，可以实现菌株JC31L从蔗糖直接高效合成乳酸单体。由于蔗糖可以用蔗糖酶快捷水解为转化糖，为此，我们需要进一步探讨蔗糖酶的应用生化属性。

图2 5 L发酵罐中出发菌JC31L利用不同碳源生产L-乳酸

表2 不同碳源L-乳酸发酵差异

2.3 蔗糖酶在模拟发酵生产条件下的酶学特征

2.3.1 热稳定性

在pH 6.5的条件下，将蔗糖酶酶液在不同温度下保温1 h，取样测定残余酶活，得到蔗糖酶的温度稳定性曲线，结果如图3所示。蔗糖酶在37～55℃范围内比较稳定。蔗糖酶在37℃下，热稳定性为93%；蔗糖酶在42℃下，热稳定性为95%。可见，其热稳定性适用于发酵过程的蔗糖水解。

图3 蔗糖酶在不同温度下的热稳定性

2.3.2 pH稳定性

在37℃条件下，将蔗糖酶酶液在不同pH缓冲液中室温下放置1 h，取样测定残余酶活，得到蔗糖酶的pH稳定性曲线，结果如图4所示。蔗糖酶在 pH 5.0～7.0范围内比较稳定。蔗糖酶在pH 6.5下，稳定性为96%；蔗糖酶在pH 7.0下，稳定性为90%。可见，此蔗糖酶的作用pH与发酵工艺pH要求吻合。

图4 蔗糖酶在不同pH下的稳定性

2.3.3 金属离子对酶活力的影响

不同金属离子对酶活的影响结果如图5所示。所测试的9种金属离子在5 mmol/L浓度下对蔗糖酶的酶活力作用不同，Mg2+、K+和Ca2+对蔗糖酶酶活力无明显作用，Zn2+、Ni+以及Mn2+对蔗糖酶酶活力有微弱抑制作用，Fe2+对蔗糖酶酶活力有明显抑制作用，Li+和Na+对蔗糖酶酶活力有明显促进作用。发酵培养基中所含的金属离子为K+和Na+，厌氧阶段用Ca(OH)2来维持发酵pH，可见，发酵中培养基的成分和pH调节剂对蔗糖酶的酶活力没有抑制作用。

2.4 同步糖化发酵合成L-乳酸工艺的建立与优化

由单糖发酵数据可知，在5 L发酵罐中进行乳酸发酵，好氧生长阶段菌株消耗75 g糖所需的时间为8 h，厌氧产酸阶段菌株消耗500 g糖所需的时间为26 h。因此，根据酶活定义选择好氧阶段蔗糖酶的基础添加量为500 U，选择厌氧阶段蔗糖酶的基础添加量为1000 U。

在5 L发酵罐中，考察了蔗糖为碳源同步糖化发酵生产L-乳酸的情况，结果如图6所示。细胞增殖阶段，蔗糖水解速率为8.8 g/h，菌体生长9 h后 生物量达到9.2 g/L，菌体生长速率为1.02 g/(L·h)；发酵产酸阶段，蔗糖平均水解速率为18.8 g/h，发酵产酸27.5 h后，L-乳酸的平均生成速率为4.95 g/(L·h)，L-乳酸积累量为136 g/L，糖酸转化率为95.2%。在整个发酵过程中可以看到，葡萄糖始终处于极低水平，蔗糖酶添加量不足应该是引起这种现象的主因，连带也影响了菌体的生长和产酸速率。

图6 菌株JC31L以蔗糖为碳源在蔗糖酶存在下的L-乳酸生产

依据上述发酵数据进行计算与分析得出，菌体生长阶段蔗糖酶添加量为750 U，发酵产酸阶段蔗糖酶添加量为1500 U。以此添加量在发酵过程中添加蔗糖酶，进行上述相似的发酵试验，结果如图7所示。菌株生长阶段，蔗糖水解速率达到12.5 g/h，菌株生长速率为1.19 g/(L·h)；发酵产酸阶段，蔗糖平均水解速率为27.7 g/h，L-乳酸的平均生成速率为5.38 g/(L·h)，L-乳酸积累量达到140 g/L，糖酸转化率为98%。利用同步糖化发酵技术，避免了高浓度葡萄糖存在时菌株对果糖代谢的影响，L-乳酸的合成速率比以蔗糖为碳源先糖化后发酵工艺提高了17.47%，显著优于已有报道[10,20]。

图7 菌株JC31L以蔗糖为原料同步糖化发酵生产L-乳酸

3 结论

本文建立并优化了以蔗糖为原料同步糖化发酵生产L-乳酸的工艺，在此工艺下，L-乳酸的平均产酸速率为5.38 g/(L·h)，厌氧产酸阶段的糖酸转化率为98%，L-乳酸的积累量为140 g/L，成功实现了蔗糖到聚合级L-乳酸的高效转化。菌株利用同步糖化发酵技术避免了高浓度葡萄糖存在时菌株对果糖代谢的影响，L-乳酸的合成速率比以蔗糖为碳源先糖化后发酵技术提高了17.47%。

本研究不仅为大宗原料蔗糖转化为大宗需求量乳酸单体的工业化生产提供了重要参考，也为以蔗糖为主要成分的碳源(甘蔗汁、甘蔗糖蜜、甜菜)为原料进行聚合级L-乳酸的工业化生产奠定了基础。这将有助于后续优化蔗糖产业的结构与丰富聚合级乳酸单体生物制造的原料多样性。