血清微小RNA-21在肾移植术后并发急性肾损伤早期诊断中的应用价值▲

覃晓虹 刘志昂 陆婷婷 杨 溢 董建辉

(中国人民解放军联勤保障部队第九二三医院1 检验科，2 移植科，广西南宁市 530021，电子邮箱：499432680@qq.com)

肾移植术后急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)与移植肾的免疫损伤、缺血损伤等密切相关[1-2]。目前，临床上一般通过监测患者术后血清肌酐水平的变化来预测是否发生肾移植术后AKI，然而当血清肌酐水平升高时，肾移植患者的肾功能可能已经呈严重减退状态，这对患者的生命安全造成严重威胁[3-4]。因此，亟待寻找一种敏感性和/或特异性较强的肾移植术后AKI的早期诊断标志物。有研究发现，血清微小RNA(microRNA，miRNA)-21表达水平的变化与肾细胞的增殖及凋亡有关[5]。但目前关于miRNA-21在肾移植术后AKI早期诊断中的应用研究仍较少。因此，本研究探讨血清miRNA-21在肾移植术后并发AKI早期诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年1月至2020年2月我院收治的84例肾移植受者作为研究对象。纳入标准：(1)在我院接受规律血液透析治疗1个月以上，且在我院接受肾移植术者；(2)AKI诊断符合《改善全球肾脏病预后组织临床实践指南》中相关标准[6]；(3)入组患者均对本研究知情同意。排除标准：(1)接受2次以上肾移植受者；(2)临床资料不全者。根据患者术后是否发生AKI分为AKI组和非AKI组，每组42例。AKI组男性27例、女性15例，年龄18～57(33.16±2.87)岁。非AKI组男性24例、女性18例，年龄17～59(32.37±4.15)岁。另选取同期在本院体检的42例健康者作为对照组，男性25例、女性17例，年龄20～61(34.09±5.12)岁。3组研究对象的性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究通过本院医学伦理委员会审批。

1.2 方法

1.2.1 样本收集：分别采集研究对象空腹静脉血3 mL，2 500 r/min离心15 min分离血清，置于-80℃保存待检。肾移植患者于肾移植术后第2天、对照组于体检当日采集。

1.2.2 仪器与试剂：ViiA 7型实时荧光定量PCR仪、TRIzol(批号：181203)及逆转录试剂盒(批号：1948302)由Life Technologies公司提供，Versa Fluor比色杯荧光分光光度计由Bio-Rad公司提供，AU680全自动生化分析仪购自美国贝克曼库乐特公司。miRNA-21引物及内参U6由上海生工生物工程公司合成，miRNA-21上游引物序列为：5′-AGCAAGUCUGAGUACUGAUGCAGUGCAUCAUGUCACCGUUGCAU-3′，下游引物序列为：5′-ACAAAUCGACUUGCAUCGCCUGU-3′；内参U6引物序列为：5′-TCTCGCTCGCACGCAGA-3′(正向)，5′-TAACGCTCACAATTTGCGGT-3′(反向)；miRNA-21逆转录引物序列为：5′-CUCGUGAUUUACUGGCCCCUGCUCGAGAGAUGAGGAUAACUAGCACUGAGCCA-3′；内参U6逆转录引物序列为：5′-CTTGCGCGGAATAGCTTCTTCAT-3′。

1.2.3 检测方法：(1)血清总RNA提取。参照TRIzol试剂盒说明书操作，检测样本中RNA浓度及纯度。(2)逆转录反应。参照逆转录试剂盒说明书操作，反应体系为20 μL，包括2 μL RNA样品、1 μL引物、1 μL逆转录酶、1 μL U6反向引物、0.5 μL RNase 抑制剂、1 μL dNTP 混合物(10 mM)、4 μL 5×RT 缓冲液、9.5 μL不含RNase的H2O 。反应条件为42℃ 30 s，92℃ 10 min，65℃ 30 s，32℃ 1 min，产物置于-20℃保存。(3)PCR扩增。采用实时荧光定量PCR仪进行扩增，反应体系共25 μL，包括2 μL稀释的cDNA、12.5 μL SYBP Premix EX TaqTMⅡ、2 μL引物、8.5 μL ddH2O。反应条件为30℃ 5 min，42℃ 10 min，85℃ 30 s，45℃ 1 min，40个循环。(4)结果分析。miRNA-21的相对表达量=2-ΔΔCt值(miRNA-21)-2-ΔΔCt值(U6)。(5)检测血清肌酐、尿酸、降钙素原及尿素氮水平。血清肌酐正常值：男性54～106 μmol/L，女性44～97 μmol/L；血清尿酸正常值：男性237.9～356.9 μmol/L，女性178.4～297.4 μmol/L。血清降钙素原正常值：0.15～14 ng/mL；血清尿素氮正常值：3.10～8.80 mmol/L。计算肾小球滤过率，男性肾小球滤过率(mL/min)=[(140-年龄)×体重(kg)]/血肌酐(μmol/L)×1.23，女性肾小球滤过率(mL/min)=[(140-年龄)×体重(kg)]/血肌酐(μmol/L)×1.04。肾小球滤过率正常值：90～125 mL/min。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验；计数资料以例数(百分比)表示，比较采用χ2检验；采用Pearson法进行相关性分析，采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析血清miRNA-21预测肾移植后AKI的临床价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组研究对象血清miRNA-21相对表达量的比较 AKI组、非AKI组、对照组的血清miRNA-21相对表达量分别为(3.51±0.98)、(1.13±0.27)、(1.04±0.19)，3组比较差异有统计学意义(F=231.196，P<0.001)，其中AKI组的血清miRNA-21相对表达量均高于非AKI组与对照组(均P<0.05)，而非AKI组与对照组的血清miRNA-21相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 AKI组和非AKI组实验室相关检测指标的比较 术后第2天，AKI组患者的血清肌酐、尿酸、降钙素原及尿素氮水平均高于非AKI组，而肾小球滤过率低于非AKI组(均P<0.05)，见表1。

表1 AKI组和非AKI组实验室相关检测指标的比较(x±s)

2.3 肾移植患者血清miRNA-21相对表达水平与肾损伤指标的相关性 由Pearson分析结果可知，肾移植患者血清miRNA-21相对表达水平与血清肌酐、尿酸、降钙素原及尿素氮均呈正相关(均P<0.05)，见表2。

表2 血清miRNA-21与肾损伤指标的相关性

2.4 血清miRNA-21相对表达量对肾移植后AKI的预测价值 ROC曲线分析结果显示，血清miRNA-21相对表达水平预测肾移植后AKI的曲线下面积为0.875(95%CI：0.834，1.971，P<0.001)，约登指数为0.754，敏感度为91.04%，特异度为86.17%，见图1。

图1 血清miR-21NA相对表达水平预测肾移植后并发AKI的ROC曲线

3 讨 论

肾移植是大多数终末期肾脏疾病患者的理想治疗方式，但移植术后患者往往并发肾损伤，影响移植肾功能的恢复[7-8]。目前，临床上一般根据患者术后尿量、血清肌酐、尿素氮等指标评价患者移植肾功能，但上述指标的诊断敏感性和特异性均较低，影响患者的病情评估[9]。既往研究显示，miRNA与狼疮性肾炎、糖尿病肾病、IgA肾病等肾脏疾病相关[10],而miRNA-21位于17q23.2染色体上，其表达与肿瘤、肾脏、心血管等疾病有关[11-12]。本课题组前期研究发现，肾移植术后并发AKI患者术后1～3 d的血清miRNA-21表达水平均高于肾移植术后无AKI患者。本研究结果也显示，AKI组的血清miRNA-21相对表达量高于非AKI组与对照组(P<0.05)，而非AKI组与对照组的血清miRNA-21相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)，提示miRNA-21在肾移植术后并发AKI患者血清中呈高表达。钟开义等[13]研究发现，miRNA-21在AKI患者血清中的表达水平明显升高，可能可以作为诊断AKI的生物学标志物。相关动物实验表明，miRNA-21可调控肾脏缺血再灌注损伤大鼠的肾小管上皮细胞坏死及凋亡[14]。由以上结果推测，miRNA-21可能来源于受损肾组织，故肾移植术后并发AKI患者的血清miRNA-21表达上调。

本研究结果显示，AKI组患者的血清肌酐、尿酸、降钙素原及尿素氮水平均高于非AKI组，肾小球滤过率低于非AKI组，且血清miRNA-21相对表达量与血清肌酐、尿酸、降钙素原及尿素氮均呈正相关(均P<0.05)，提示血清miRNA-21表达量与肾移植术后并发AKI患者肾损伤的严重程度有关。林建等[15]的研究表明，miRNA-21在AKI患者血清中表达升高，可作为患者预后的评价指标。本研究ROC曲线分析结果显示，血清miRNA-21相对表达水平预测肾移植术后并发AKI的曲线下面积为0.875，约登指数为0.754，敏感度为91.04%，特异度为86.17%，说明血清miRNA-21表达量对预测肾移植术后并发AKI具有重要价值，可作为预测肾移植术后并发AKI的评价指标。曹李娜等[16]的研究也发现，miRNA-21诊断心脏介入术后并发AKI的特异度较高，可作为AKI诊断的生物学标志物。

综上所述， miRNA-21在肾移植后并发AKI患者血清中呈高表达，其与患者病情严重程度密切相关，或可作为肾移植后并发AKI的早期诊断指标。由于本研究纳入的样本量有限，研究结果存在一定局限性，今后需加大样本量，深入探讨miRNA-21表达量影响肾移植后并发AKI的机制。