超声波辅助提取玉米花丝多酚工艺优化及其抑菌活性研究

任世达，方晓敏，罗雁非，贾 睿，刘倩男，蔡 丹,*

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118；2.小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林长春 130118；3.长春海关技术中心，吉林长春 130062）

玉米花丝（Zea maysL.）又称玉蜀黍花、玉米须，是玉米雌穗花柱和柱头的统称。玉米花丝中富含多糖、多酚、有机酸和生物碱等成分[1]，具有促进肠胃蠕动[2]、抗氧化[3]、增强免疫力[4]、抗疲劳[5]、降血糖[6]、抗癌抑瘤[7−8]和抑菌[9]等生理活性。玉米花丝多酚是玉米花丝重要活性成分之一，研究人员从中分离出了儿茶素、表儿茶素、原花青素等多种物质[10−11]，具有抗氧化、降血压[12−13]、保护神经[14]等功能活性。

近年来，国内外学者对玉米花丝多酚主要开展了分离提取及抗氧化活性评价等研究。多酚常见的提取方法主要有溶剂提取法、超声波辅助提取法[15]、超临界CO2萃取法[16]、酶解提取法[17]和亚临界水萃取法[18]等，其中超声波以其高效简便、绿色安全等优点而被广泛应用[19−20]。李静等[21]、侯敏娜等[22]开展了超声波辅助提取玉米须多酚的工艺研究，但玉米花丝品种不明确，对于玉米花丝多酚的抑菌活性研究鲜有报道。

本文首次以甜糯玉米品种垦糯1 号玉米花丝为主要原料，考察超声波频率、超声波功率、超声波温度和超声波时间各因素对玉米花丝多酚提取量的影响，采用响应面法优化提取工艺，并初步探讨玉米花丝多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性，为进一步深入研究品种对玉米花丝成分构成的影响奠定研究基础，同时为糯性玉米品种花丝资源的高附加值利用提供必要的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米花丝 垦糯1 号 实验室提供；大肠杆菌（E.coliATCC8739），金黄色葡萄球菌（S.aureusATCC12600） 实验室提供；没食子酸（分析纯（98.5%）、福林酚（分析纯98%）、无水碳酸钠（分析纯99.8%）、无水乙醇（分析纯99%） 上海源叶生物科技有限公司。

101A-1ET 电热恒温鼓风干燥箱 上海试验仪器厂有限公司；RE-52AA 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；Allegra X-30R 高速离心机 美国Beckman 公司；KQ3200DB 型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；JK-3200B 型超声波清洗器 合肥金尼克机械制造有限公司；FLUO star Omega 型全自动酶标仪 德国 BMG 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多酚提取工艺 将玉米花丝清洗干净，烘干至恒重，粉碎过100 目筛。称取1.0 g 玉米花丝粉，在一定液料比、乙醇浓度、超声波频率、超声波功率、超声波温度和超声波时间的条件下，提取3 次，离心过滤后取上清液旋转蒸发浓缩样品，蒸馏水定容至50 mL，待测。

1.2.2 多酚含量的测定

1.2.2.1 没食子酸标准曲线的制作 制备1 mg/mL的没食子酸标准溶液，分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 定容至10 mL，得到质量浓度为0、10、20、30、40、50、60 μg/mL 的标准溶液，吸取上述标准溶液各 50 μL，依次加入 200 μL 双蒸水和250 μL 福林酚工作液，室温下避光静置 5 min 后加入 250 μL 10% 无水碳酸钠溶液，再置于室温下避光反应 1 h，随后测定其在波长 765 nm 处的吸光度值。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。得到线性回归方程y=0.0056x+0.0756，其中R2= 0.9995。

1.2.2.2 玉米花丝多酚含量的测定 按照1.2.1 中的方法提取玉米花丝多酚，含量测定方法同标准曲线。计算公式如下：

式中，C—玉米花丝多酚的质量浓度，mg/mL；V—提取液体积，mL；N—稀释倍数；M—玉米花丝粉质量，g。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 液料比对玉米花丝多酚提取量的影响 在乙醇浓度60%，超声波频率40 kHz，超声波功率300 W，超声波温度60 ℃，超声波时间40 min 条件下，考察液料比为10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 时对玉米花丝多酚提取量的影响。

1.2.3.2 乙醇浓度对玉米花丝多酚提取量的影响在液料比30:1，超声波频率40 kHz，超声波功率300 W，超声波温度60 ℃，超声波时间40 min 条件下，考察乙醇浓度为40%、50%、60%、70%、80%时对玉米花丝多酚提取量的影响。

1.2.3.3 超声波频率对玉米花丝多酚提取量的影响

在液料比30:1，乙醇浓度60%，超声波功率300 W，超声波温度60 ℃，超声波时间40 min 条件下，考察超声波频率为30、35、40、45、50 kHz 时对玉米花丝多酚提取量的影响。

1.2.3.4 超声波功率对玉米花丝多酚提取量的影响

在液料比30:1，乙醇浓度60%，超声波频率40 kHz，超声波温度60 ℃，超声波时间40 min 条件下，考察超声波功率为100、200、300、400、500 W 时对玉米花丝多酚提取量的影响。

1.2.3.5 超声波温度对玉米花丝多酚提取量的影响

在液料比30:1，乙醇浓度60%，超声波频率40 kHz，超声波功率300 W，超声波时间40 min 条件下，考察超声波温度为40、50、60、70、80 ℃时对玉米花丝多酚提取量的影响。

1.2.3.6 超声波时间对玉米花丝多酚提取量的影响

在液料比30:1，乙醇浓度60%，超声波频率40 kHz，超声波功率300 W，超声波温度60 ℃条件下，考察超声波时间20、30、40、50、60 min 时对玉米花丝多酚提取量的影响。

1.2.4 响应面实验 利用Design Expert 10，在单因素实验基础上，选定A 超声波频率、B 超声波功率、C 超声波温度、D 超声波时间，进行4 因素3 水平响应面试验。因素及水平见表1。

表1 响应面分析试验因素和水平Table 1 Levels and factors of response surface methodology

1.2.5 玉米花丝多酚抑菌活性测定

1.2.5.1 最小抑菌浓度的测定 采用二倍梯度稀释法[23]，并稍加修改。取分别稀释至106CFU/mL 的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液，加入到无菌的96 孔板中，梯度稀释使得大肠杆菌每孔的多酚抑菌液终浓度为10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL，金黄色葡萄球菌每孔的多酚抑菌液终浓度为8、4、2、1、0.5 mg/mL，将96 孔板放入恒温培养箱中培养24 h，以肉眼观察到无明显沉淀为最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.2.5.2 抑菌生长曲线的测定 参考卢彩会[24]的方法，并稍加修改。分别取稀释至106CFU/mL 的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液，将不同质量浓度的玉米花丝多酚溶液（终浓度分别为0、1、2、4 MIC）加入试管中，在最适温度下振荡培养24 h，每隔1 h 测定菌液在600 nm 处的吸光度值，绘制生长曲线。

1.3 数据处理

使用 Origin2017 和Design Expert.10 进行数据的处理和绘图分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 液料比对玉米花丝多酚提取量的影响 图1为液料比对玉米花丝多酚提取量的影响。从图中可以看出随着液料比的增大，使得玉米花丝与提取剂的接触面积增大，多酚类物质能更加充分的从物料中溶出，因此玉米花丝多酚的提取量也逐渐增大，且当液料比为30:1 时，多酚提取量达到最大；但当提取剂与玉米花丝的比例继续增加，多酚提取量反而稍有降低，这是由于当液料比为30:1 时，玉米花丝中的多酚成分已基本溶出，因此即使继续增加液料比，也不会提高多酚的提取量，而因为溶剂的增多，致使玉米花丝中其它醇溶性成分的溶出，阻碍了多酚成分的溶出[25]。

图1 液料比对玉米花丝多酚提取量的影响Fig.1 The effect of liquid-solid ratio on extraction amount of corn silk polyphenols

2.1.2 乙醇浓度对玉米花丝多酚提取量的影响 图2为乙醇浓度对玉米花丝多酚提取量的影响。从图中可以看出在乙醇浓度达到60%之前，随着乙醇浓度的增加，玉米花丝多酚的提取量持续增大，且当乙醇浓度为60%时，多酚提取量最高，此时为13.13 mg/g，但随着乙醇浓度的继续增加，玉米花丝多酚提取量不再继续增加，这是因为当乙醇浓度过高时，会导致极性降低，因此会抑制多酚类物质从玉米花丝中提出，且乙醇浓度越高，成本越高[26]。因此最终确定乙醇提取剂的浓度为60%。

图2 乙醇浓度对玉米花丝多酚提取量的影响Fig.2 The effect of ethanol concentration on extraction amount of corn silk polyphenols

2.1.3 超声波频率对玉米花丝多酚提取量的影响图3 为超声波频率对玉米花丝多酚提取量的影响。从图中可以看出随着超声波频率的增大，玉米花丝多酚提取量也随之增大，且当超声波频率为40 kHz时，多酚提取量达到最大，但当超声波频率大于40 kHz时，玉米花丝多酚的提取量却逐渐降低。这是因为超声波频率产生的空化作用，击碎效应等随着超声波频率的增加而强度增大，使得细胞壁破碎速度加快，玉米花丝细胞分子内部间隙增大，增加了多酚的溶出速率，但随着超声波频率的继续增大，多酚物质的结构遭到破坏，反而降低了提取量[27]。

图3 超声波频率对玉米花丝多酚提取量的影响Fig.3 The effect of ultrasonic frequency on extraction amount of corn silk polyphenols.

2.1.4 超声波功率对玉米花丝多酚提取量的影响图4 为超声波功率对玉米花丝多酚提取量的影响。从图中可以看出在超声波功率达到300 W 之前，随着超声波功率的增大，玉米花丝多酚提取量也随之增加，并且当功率为300 W 时，玉米花丝多酚的提取量最大，此时为13.15 mg/g。这是因为随着超声波功率的增强，超声所产生的空化效应增强，有效促进了溶剂向花丝细胞内部的扩散，使得细胞内的多酚成分可以充分溶出[28]，并在超声波功率为300 W 时，玉米花丝多酚具有最高的提取量，但随着超声波功率的继续升高时，过强的空化效应反而会破坏多酚物质的结构，导致提取量的稍有降低。

图4 超声波功率对玉米花丝多酚提取量的影响Fig.4 The effect of ultrasonic power on extraction amount of corn silk polyphenols

2.1.5 超声波温度对玉米花丝多酚提取量的影响图5 为超声波温度对玉米花丝多酚提取量的影响。从图中可以看出在温度达到60 ℃之前，超声波温度的升高可以有效促进多酚的溶出，当超声波温度为60 ℃时，多酚提取量最高，为13.10 mg/g，但随着超声波温度继续升高时，玉米花丝多酚的提取量却有所降低。这是由于超声场强工作时会产生一定的热效应，加之过高的提取温度，会造成局部高温，导致多酚的分解[29]，致使玉米花丝多酚提取量有所降低。

图5 超声波温度对玉米花丝多酚提取量的影响Fig.5 The effect of ultrasonic temperature on extraction amount of corn silk polyphenols

2.1.6 超声波时间对玉米花丝多酚提取量的影响图6 为超声波时间对玉米花多酚提取量的影响。从图中可以看出随着超声波处理时间的延长，且当处理时间少于40 min，多酚提取量与超声波处理时间呈正相关，当超声波时间为40 min 时，多酚具有最高的提取量。这是因为使用超声波处理花丝的时间越长，使得花丝可以与提取剂更加充分的接触，并伴随超声波产生的机械效应，使得玉米花丝多酚可以有效地从花丝中释放出来，因此在提取时间为40 min 时，多酚提取量最大为13.20 mg/g，但同样由于过长的处理时间，会伴随着其它因素的影响，对多酚结构具有一定的破坏作用[30]，因此提取量有所降低。

图6 超声波时间对玉米花丝多酚提取量的影响Fig.6 The effect of ultrasonic time on extraction amount of corn silk polyphenols

2.2 响应面优化试验结果分析

以玉米花丝多酚提取率为响应值，选定A 超声波频率、B 超声波功率、C 超声波温度、D 超声波时间，进行4 因素3 水平响应面试验，响应面设计及结果见表2。

表2 试验设计及结果Table 2 Design and experimental results

2.2.1 模型建立与显著性分析 由Design Expert.10软件分析得到响应面回归拟合方程如下：多酚提取量（mg/g）=13.36+1.26A+0.28B+0.19C+0.46D−0.088AB−0.19AC−0.18AD+0.075BC−0.18BD−0.12CD−1.20A2−0.54B2−0.52C2−0.75D2

方差分析如表3 所示。从表中可以看出，模型F值为130.85，P值小于0.0001，模型拟合度较高，说明模型可以很好地反应各因素对响应值的影响；失拟项P值为0.8299，大于0.05，表明非试验因素对试验结果影响较小；模型的相关系数R2=0.9924，R2adj=0.9848 和R2pre=0.9705 的差值小于0.2，再次说明模型的合理性，变异系数CV=1.14%，精密度38.642，表明模型可靠。各因素对玉米花丝多酚提取量的影响极显著，其中交互项其中交互项AC、AD、BD 对提取量影响显著（0.01D>B>C，即超声波频率影响最大，依次为超声波时间、超声波功率和超声波温度。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis.

如图7 所示为利用回归模型得到的对玉米花丝多酚提取量影响显著的AC、AD、BD 的响应面图和等高线图，从图中可以看出各因素交互作用均为开口向下的平滑曲面，其中超声频率和超声温度，超声频率和超声时间，超声功率和超声时间三组交互响应面弯曲程度较大，说明这三组交互因素对玉米花丝多酚提取量的影响显著，这也与方差分析结果一致。

图7 各因素交互作用对玉米花丝多酚提取量影响的响应面图Fig.7 Response surface diagram of the interaction of various factors on the extraction amount of corn silk polyphenols

2.2.2 试验验证 由模型分析结果，预测玉米花丝多酚最佳提取工艺为超声波频率42.465 kHz，超声波功率350.1 W，超声波温度56.17 ℃，超声波时间45.37 min，此时玉米花丝多酚提取量为13.502 mg/g。根据实际情况，调整提取条件为：超声波频率40 kHz，超声波功率350 W，超声波温度56 ℃，超声波时间45 min，得到玉米花丝多酚提取量为（13.31±0.12） mg/g，与预测结果相近，说明模型拟合效果良好。

2.3 玉米花丝多酚抑菌活性结果分析

2.3.1 最小抑菌浓度的测定 表4 为玉米花丝多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度。从中可以看出，玉米花丝多酚对大肠杆菌的MIC 为2.5 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC 为2 mg/mL，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的代表菌种，表明玉米花丝多酚对革兰氏阳性菌具有更强的抑制活性。

表4 玉米花丝多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度Table 4 minimum inhibitory concentration of corn silk polyphenols against Escherichia coli and Staphylococcus aureus

2.3.2 玉米花丝多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长曲线的影响 图8 为不同浓度玉米花丝多酚对两种供试菌生长曲线的影响。图（A）为不同浓度玉米花丝多酚对大肠杆菌生长曲线的影响，从图中可以看出，与对照组相比，1 MIC 玉米花丝多酚处理的大肠杆菌出现生长迟滞现象，将大肠杆菌进入对数生长期的时间从5 h 延长至7 h；2 MIC 的玉米花丝多酚处理的大肠杆菌则未出现典型的生长周期现象。图（B）为不同浓度玉米花丝多酚对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响，与大肠杆菌相似，玉米花丝多酚对金黄色葡萄球菌的抑制情况也呈现一定的剂量依赖性。其中，1 MIC 玉米花丝多酚可将金黄色葡萄球菌进入对数生长期的时间从5 h 延长至7 h；2 MIC 玉米花丝多酚可将其进入对数生长期的时间延长至9 h。当玉米花丝多酚浓度达到4 MIC 时，两种供试菌的生长均完全受到抑制。

图8 玉米花丝多酚对两种供试菌生长曲线的影响Fig.8 The effects of corn silk polyphenols on growth curves of two tested bacteria

3 结论

本实验以垦糯1 号玉米花丝为主要原料，在单因素实验的基础上优化超声波辅助提取玉米花丝多酚工艺，得到最佳超声波辅助提取玉米花丝多酚的工艺条件为：超声波频率40 kHz，超声波功率350 W，超声波温度56 ℃，超声波时间45 min，此时得到玉米花丝多酚提取率为（13.31±0.12） mg/g，与预测值接近，模型拟合效果良好。抑菌试验证明：玉米花丝多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为2.5 mg/mL 和2 mg/mL，不同浓度玉米花丝多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑制效果，且当玉米花丝多酚浓度为4 MIC 时，可以达到完全抑制其生长的效果，证明玉米花丝多酚可作为天然的抑菌剂，也为糯性玉米品种花丝资源的应用奠定理论基础。