牛奶中β-内酰胺酶检测方法的研究

◎ 李 滨，张俊杰，徐 洁，张 磊

（江苏海洋大学 食品科学与工程学院，江苏 连云港 222000）

随着我国对牛奶中抗生素残留问题关注度的提高和部分乳制品企业“无抗奶”目标的制定和提出，抗生素残留成为了人们关注的食品健康问题，“无抗奶”这个名词也成为了生产者和消费者重点关注的话题。β-内酰胺酶作为一种常见的抗生素分解酶常被不法商贩用来掩盖牛奶中的抗生素残留[1]。目前市场上用来检测抗生素残留的方法有微生物法、碘量法、酸量法、显色头孢菌素法和高效液相色谱法等。其中微生物法与碘量法都因其具有成本低[2]、操作简单[3]等特点而被实验室广泛使用，但前者检测时间过长[4]，且无法定性、定量分析抗生素种类及含量[5]，而后者反应灵敏度低[6]，实验重现性也较差[7]，因此二者均难以在市场推广。酸量法与显色头孢菌素法原理相似，均利用颜色的变化对β-内酰胺酶进行检测分析，但酸量法无法区分内源性和外源性的β-内酰胺酶且不能用酶动力学分析[8]，而显色头孢菌素法则由于假阳性概率较大[9]，同样无法满足市场需求。高效液相色谱法是目前被广泛应用的一种理化检测方法，该方法灵敏度较高、检测时间短、效率高且自动化程度高[10]，但检测成本也高，样品前处理较烦琐[11]，检测程序复杂、费用较高[12]，一般在大型实验室使用，更适合于精确测定。

本研究根据β-内酰胺酶的性质以及其分解产物（青霉素噻唑酸）的性质作为出发点进行研究，设计出一种新的检测方法——硫酸铜-紫外分光光度计法。该方法操作简单，检测成本极低，有效降低了β-内酰胺酶的最低检出限，满足市场检测需求，为β-内酰胺酶的检测方法开发提供了新的解决思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

市售鲜牛奶（新希望乳业有限公司），牛奶β-内 酰胺酶快速检测试纸条（深圳市易瑞生物科技有限公司），青霉素钾标准品（合肥博美生物科技有限公司），β-内酰胺酶标准品（上海阿拉丁生化科技有限公司），硫酸铜（南京化学试剂一厂），三氯乙酸（国药集团化学试剂有限公司），甲基红指示剂，氢氧化钠，头孢硝噻吩（长沙俄里翁生物科技有限公司），二甲基亚砜（丽媛棠科教仪器商城）

1.1.2 仪器

电热恒温水浴锅（HW-YS，浙江舟山市定海区海源仪器厂）；自动纯水蒸馏器（SZ-93，上海亚荣生化仪器厂）；电子天平（BP221S，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；立体式冰箱（BCD-205F/T，青岛海尔电器有限公司）；台式离心机（TL-5.0，上海市离心机械研究所）；精密pH计（PHS-3C，上海精密科学仪器有限公司-雷磁仪器）；测色色差计（WSC-S，上海仪电物理光学仪器有限公司）；超声波清洗仪（JPS-100AL，上海煜南仪器有限公司）。

1.2 实验方法

按质量比无抗奶粉∶蒸馏水=1∶10配制含青霉素钾质量浓度为5 mg·mL-1，β-内酰胺酶浓度 60 U·mL-1的样品牛奶溶液及空白（不含β-内酰胺酶）牛奶溶液，在最适酶促反应温度32.5 ℃水浴 50 min[13]；取空白牛奶（不含β-内酰胺酶）5 mL，加入5 mL的三氯乙酸（TCA），用旋涡混合器充分振荡，使其混合均匀，然后放入多用途台式冷冻高速离心机中，转速8 000 r·min-1[14]，离心15 min，离心后取上清液10 mL放入烧杯，添上标签样品1；取含β-内酰胺酶及青霉素钾的样品牛奶溶液5 mL，加入5 mL的TCA，用旋涡混合器充分振荡，使其混合均匀，然后放入多用途台式冷冻高速离心机中，转速8 000 r·min-1，离心15 min，离心后取上清液10 mL放入烧杯，添上标签样品2；在样品1和样品2中分别加入0.2 mol·L-1的硫酸铜溶液3 mL作为反应剂和显色剂[15]，测定溶液OD值。

2 结果与分析

2.1 各个影响因素的优化

2.1.1 样品最大吸光度的测定

在最适酶促反应条件下，分别测定溶液在波长200～600 nm的OD值。如图1所示，在200～263 nm阶段，OD值呈上升趋势，随后下降直至平稳，溶液在263 nm处有最大吸收峰。

图1 样品最大吸收波长的测定图

2.1.2 底物青霉素钾与硫酸铜用量及样液添加量优化

由图2可知，当酶浓度达到2 mg·mL-1时其峰值与5 mg·mL-1基本相同，由于5 mg·mL-1青霉素钾浓度是过量的，且青霉素钾浓度过高时会自身分解，所以5 mg·mL-1以上不再试验。出于节约材料、高效实验的目的选择底物青霉素钾用量为2 mg·mL-1。

图2 不同青霉素钾用量的样品检测光谱图

由图3可知，0.2 mol·L-1的硫酸铜试剂添加量为 0.150 mL时其光谱的峰值最大，但0.100 mL和0.150 mL的硫酸铜试剂添加量的光谱图基本相同，出于节约材料以及硫酸铜添加量不宜过多方面考虑，0.2 mol·L-1的硫酸铜试剂最适添加量为0.100 mL。

图3 不同硫酸铜添加量的样品光谱图

由图4可知，样液添加量为2.7 mL时，该样液的光谱峰值最大，所以样液的最佳添加量为2.7 mL。

图4 不同样液添加量的样品光谱图

综上所述，可知最佳条件为底物浓度2 mg·mL-1， 0.2 mol·L-1的硫酸铜试剂添加量为0.100 mL，样液添加量为2.7 mL，反应时间为18 min。

2.2 标准曲线及最低检出限的确定

紫外-可见分光光度计分别测定β-内酰胺酶的浓 度 为5 U·mL-1、15 U·mL-1、30 U·mL-1、60 U·mL-1和100 U·mL-1的5组样品在263 nm处的吸光度，标准曲线如图5所示。β-内酰胺酶与其在263 nm处的OD值呈比较好的线性关系，由此可以初步确定其最低检出限为5 U·mL-1。

图5 不同酶浓度样品峰值的标准曲线图

3 结论

运用紫外-可见分光光度计扫描得到络合物在263 nm 处有最大吸收峰，底物浓度2 mg·mL-1，0.2 mol·L-1的硫酸铜试剂添加量为0.100 mL，样液添加量为2.7 mL，反应时间为18 min的最优条件下建立β-内酰胺酶检测线性关系，R2为0.976 1，相关性良好，最低检出限为5 U·mL-1。该硫酸铜-紫外分光光度计法是一种检测成本低、易于操作、检出限较低的检测β-内酰胺酶方法，该方法可基本满足目前市场需求。