UPLC-MS/MS 法测定烟叶中呋虫胺及其代谢物的残留

杨志富，欧晓明，曾利红，梁 骥，梁贵平，刘义珂

（湖南化工研究院有限公司，国家农药创制工程技术研究中心，农用化学品湖南省重点实验室，湖南加法检测有限公司，湖南 长沙 410014）

呋虫胺（dinotefuran），化学名称为1-甲基-2-硝基-3-（四氢-3-呋喃甲基）胍，简称DNF，是日本三井化学株式会社开发的第三代烟碱类杀虫剂，其杀虫谱广，内吸、渗透作用卓越[1]，作用于乙酰胆碱受体，使昆虫麻痹致死[2]。

呋虫胺使用后，在动植物体内可产生多个代谢产物。研究表明，呋虫胺以茎叶喷雾和土壤表面施药的方式使用后，在水稻植株、糙米、稻壳上的主要代谢物为1-甲基-3-[（3-四氢呋喃）甲基]脲（简称UF）和1-甲基-3-[（3-四氢呋喃）甲基]二氢胍盐（简称DN），DNF、UF、DN 的分子结构式见图1。2012 年农药残留联席会议（JMPR）规定，呋虫胺在植物体内的残留物监测定义为呋虫胺，膳食风险评估定义为呋虫胺与UF、DN 的总和[3]。

图1 呋虫胺及其代谢物DN、UF 分子结构式

目前，检测DNF、UF、DN 残留的方法主要为液相色谱法和液相色谱串联质谱法，涉及到的样品基质为水稻[4-7]、蔬菜[8-11]、水果[12]、棉花[10]、茶叶[13]、蜂产品[14]等。相同农药在不同作物中检测因内含物不同对检测方法的要求也不同，烟叶中含有较多色素、生物碱、类脂、多酚物质等会干扰目标物的检测，目前尚未见烟叶中关于呋虫胺检测的相关报道。国际烟草科学研究合作中心（CORESTE）和中国烟草总公司企业标准（YQ50—2014 烟叶农药最大残留限量[15]）暂未制定烟草中呋虫胺的最大残留限量，呋虫胺在我国也暂未在烟草上获得登记。受农药生产企业委托，笔者以15%呋虫胺·联苯菊酯可湿性粉剂在烟草上的残留登记试验项目为背景，建立了超高效液相色谱串联质谱同时测定烟叶中DNF、UF、DN 残留的分析检测方法，以期为烟叶中呋虫胺及其代谢物残留量的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集湖南试验点种植的中烟90 烟叶作为空白样品，参考YC/T 42—1996 烟草基本烘烤技术规程[16]烘烤成干烟叶，烘烤后的干烟叶空白样品粉碎后-18℃以下密封保存。

主要试剂有呋虫胺标准品[99.0%，国家农药质量监督检验中心（沈阳）]，呋虫胺代谢物UF 标准品（93.2%，上海安谱试验科技股份有限公司），呋虫胺代谢物DN 标准品（98.8%，上海安谱试验科技股份有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，安可化工有限公司），甲酸（色谱纯，上海安谱实验室有限公司），试验用水为超纯水。

主要仪器有Agilent 1290/G6470 三重四级杆液质联用仪（美国安捷伦公司）、SPS 402F 型电子天平[0.01g，梅特勒·托利多（常州）测量技术有限公司]、AL204 型电子天平[0.000 1g，梅特勒·托利多国际贸易（上海）有限公司]、Hei-vap 型旋转蒸发仪[海道尔夫仪器设备（上海）有限公司]。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制 （1）单个标准储备液：准确称取DNF、UF、DN 的标准品各 0.025 g（精确至0.000 1 g），以乙腈溶解并定容至50 mL，分别配制成质量浓度为500 mg/L 的单个标准储备液，于-20℃避光密封储存备用。（2）混合标准溶液的配制：分别准确量取一定体积的单个标准储备液，用乙腈配制成质量浓度为2.0 mg/L 的DNF、UF 和DN 的混合标准溶液，于-20℃保存备用。定量测定时，用乙腈和烟叶空白基质提取液配制溶剂和基质系列混合标准溶液。

1.2.2 样品前处理 称取烟叶2 g（精确至0.01 g）于50 mL 的离心管中，加入20 mL 提取液（丙酮、乙腈、甲醇、超纯水和0.5%的甲酸溶液）超声15 min 后涡旋2 min，5 000 r/min 离心3 min，过滤，重复提取1 次，合并上清液并取4 mL 转入装有不同量（60、80、100 mg）净化材料[石墨化碳黑（GCB）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、C18 净化剂]的5 mL 离心管中，涡旋2 min，5 000 r/min 离心5 min，转移上清液并用甲醇-水（体积比1 ∶1）混合溶液定容至5 mL 容量瓶中，过0.22 μm 滤膜，超高效液相色谱-串联质谱测定。

1.2.3 仪器分析条件 （1）色谱条件：Agilent EC-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相A（0.1%甲酸水溶液）；流动相B（0.1%甲酸甲醇溶液）；柱温30℃；进样体积5 μL；通过降低流速和调整流动相初始比例（原则是前处理后得到的待测样品中各溶剂比例与流动相中各溶剂比例相适应）等手段优化色谱条件。（2）质谱条件：配制0.1 mg/L 的DNF、DN、UF单一标准溶液，全扫描确定母离子后，采用自动调谐对各目标化合物进行质谱条件优化，从而得到最优质谱测定条件。

1.2.4 方法学验证 （1）标准曲线绘制及基质效应：烟叶中含有大量的杂质，虽经过PSA 和C18 净化，但残存的杂质仍可能对农药目标物产生较强的基质效应，对检测结果造成影响。为验证基质效应，用乙腈和烟叶空白基质提取液分别配制1、2、5、20、50、100 μg/L 的系列标准工作液，根据试验确定的仪器分析条件平行测定3 次，以目标物峰面积（y）对其质量浓度（x，μg/L）绘制标准曲线，计算基质标液与溶剂标液的斜率比，即基质效应（ME）。（2）定量限（LOQ）：经空白烟叶加标试验，以10 倍信噪比时空白基质加标浓度确定方法的定量限。（3）回收率和精密度：在空白基质中进行添加回收试验，添加水平为0.05、1.0、10 mg/kg，每个添加水平重复5 次，考察该检测方法的回收率和精密度。

1.2.5 样品检测 采用该研究建立的检测方法对2019年采集自湖南永州、山东青岛、贵州黔南州、云南曲靖、广西桂林、辽宁辽阳、福建福安的烟叶样品（依托于15%呋虫胺·联苯菊酯可湿性粉剂在烟草上的残留登记试验项目）进行检测。15%呋虫胺·联苯菊酯可湿性粉剂以剂量56.25 g/hm2（有效成分，制剂375 g/hm2）在处理小区施药1 次，于施药后间隔14、21 d采集烟叶样品进行检测分析。

2 结果与分析

2.1 最佳提取溶剂

呋虫胺的极性、亲水性较强，且在碱性环境中不稳定。在空白烟叶中添加1.0 mg/kg 的标准溶液进行加标回收试验，结果显示，丙酮、甲醇作为提取液时，3 种目标物的回收率均在60%以下；当乙腈作为提取液时DN 的回收率为65%，DNF 的回收率为70%、UF 的回收率为72%；纯水的提取效果较好，3 种目标物的回收率均在73%～77%之间；当采用0.5%甲酸溶液提取时，3 种目标物的回收率上升到82%～88%之间，表明适当酸性条件有助于目标物的离子化，以便提高回收率。故试验确定以0.5%甲酸溶液为最佳提取溶剂。

2.2 最适净化材料

为保护仪器，降低提取液中杂质引起的基质效应，研究对净化材料及其用量进行了探索。GCB 对色素有很好的吸附效果，但可能会对与其平面结构类似的某些农药有较强的吸附作用，从而影响检测结果；因此，GCB 净化时，3 种目标物的回收率都很低，为30%～55%。PSA 可去除烟草中的极性色素、类脂等杂质，且杂质干扰较少，当使用量在80 mg 时效果最佳，3 种目标物的回收率在70%～110%之间。C18 对烟草中的非极性组分具有较强的吸附作用，且杂质干扰也较少，当使用量在80 mg 时效果最佳，3 种目标物的回收率在70%～105%之间。鉴于此，该研究采用80 mg PSA+80 mg C18作为净化材料，其除杂效果可叠加，杂质干扰也最少，回收率在75%～98%之间。

烟叶样品提取后，用甲醇-水（体积比1 ∶1）混合溶液定容至5 mL，使待测液与流动相初始比例相似，从而获得较好的峰形，同时稀释提取液也可降低基质本底的干扰。

2.3 最佳检测条件

优化后的梯度洗脱程序见表1。优化后的色谱条件如下：电喷雾离子源；正离子电离模式（ESI+）；检测方式为多反应监测（MRM）；离子喷雾电压为3.5 kV；雾化器压力为0.31 MPa；干燥气温度为300℃；干燥气流速5 L/min；鞘气流速11 L/min；电喷雾质谱参数信息见表2。

表1 液相梯度洗脱程序

表2 电喷雾质谱参数

以上述参数获得的DN、UF、DNF 基质标MRM图如图2 所示，3 种目标物的保留时间恰当，获得峰形较好。往流动相A（超纯水）和流动相B（甲醇）中分别加入0.1%的甲酸可以提高3 种目标物的离子化效率，进而增强响应。

图2 1 μg/L 的DN、UF、DNF 基质标MRM 图

2.4 方法学验证结果

2.4.1 基质标准曲线和基质效应 烟叶基质标准溶液中，3 种目标物在1～100 μg/L 范围内具有较好的线性关系，相关系数均≥0.994 8（表3）。当ME ＞1.1 时，表示基质增强效应；ME ＜0.9 时，表示基质效应减弱；0.9 ＜ME ＜1.1 时，基质效应可以忽略。由表3 可知，3 种目标物在烟叶基质中存在一定的基质效应，故该研究选择通过基质匹配外标法进行定量。

表3 3 种目标物的溶剂标准曲线和基质标准曲线

2.4.2 定量限（LOQ） 经空白烟叶加标试验，以10倍信噪比时空白基质加标浓度确定方法的定量限，DNF、DN、UF 的定量限均为0.05 mg/kg。因样品经过前处理后将实际浓度稀释了25 倍进样检测，相较于呋虫胺在烟草上暂未制定最大残留限量（MRL）值，0.05 mg/kg 的定量限可满足检测要求。

2.4.3 回收率和精密度 如表4 所示，DNF、UF、DN 在烟叶中的平均回收率为88%～92%、77%～92%、87%～92% ，RSD 为2%～11%、2%～8%、2%～3%。以上结果均满足NY/T 788—2018 农作物中农药残留试验准则的要求[17]。

表4 DNF、UF 和DN 在烟叶中的添加回收率（n=5）

2.5 样品检测

根据JMPR2012 年的评估报告，按残留物监测定义计算，各样品烟叶中呋虫胺的残留量最大值为2.45 mg/kg；按残留物膳食摄入风险评估定义（以呋虫胺表示的残留量=呋虫胺残留量+UF 残留量×1.3+DN残留量×1.3）计算，各样品烟叶中以呋虫胺表示的残留量最大值为5.75 mg/kg。

3 结 论

为准确测定烟草样品中呋虫胺（DNF）及其代谢物（DN、UF）的残留量，建立了烟草样品中DNF、DN、UF 的提取及超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测的方法。样品经0.5%甲酸水溶液超声提取，80 mg PSA+80 mg C18混合净化剂净化，用Agilent EC-C18色谱柱分离，再采用正离子多反应监测（MRM）模式进行电喷雾电离串联质谱测定。结果表明：DNF、DN、UF 在1～100 μg/L 范围内线性关系良好，相关系数均≥0.994 8；DNF、DN、UF 在烟叶中的最低检测浓度均为0.05 mg/kg；不同加标水平的试验中DNF、DN、UF 的平均回收率分别为88%～92%、77%～92%和87%～92%，相对标准偏差分别为2%～11%、2%～8%、2%～3%。该方法操作简单、快速，正确度和精密度均较高，可同时检测烟叶中DNF、DN、UF 的残留量，能满足烟草中呋虫胺的监测及该药的登记试验需求。