基于矿物元素指纹差异的榴莲产地甄别

周秀雯，吴 浩，陈海泉，颜 治，靳保辉，谢丽琪，赵 燕，赵超敏，陈 辉，潘家荣,

（1.中国计量大学生命科学学院，浙江省海洋食品品质及危害物控制技术重点实验室，海洋食品加工质量控制技术与仪器国家地方联合工程实验室，浙江 杭州 310018；2.深圳海关食品检验检疫技术中心，广东 深圳 518054；3.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081；4.上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135；5.中国检验检疫科学研究院，北京 100176）

榴莲（Durio zibethinusMurray）是东南亚及临近岛屿最重要的热带季节性水果之一，最早起源于马来半岛[1]，现多种植于泰国、马来西亚、柬埔寨等东南亚国家。作为热带水果的典型代表，榴莲有较强的抗氧化特性和生物活性[2-3]，还能有效降低血清胆固醇水平，减少冠心病的发病率[4]，深受我国消费者的喜爱。然而由于地形气候等环境条件限制，榴莲果树在中国存活率较低，暂无作为商业用途的榴莲引种，因此我国榴莲主要依赖于进口。据海关总署数据发布[5]，2019年我国鲜榴莲进口金额为16.0亿 美元，同比增长47%，占整个水果进口市场的16.84%。目前，榴莲市场判断榴莲产地及品种的方法主要依靠专业人士的感官鉴别[6]，主观性强，且受外部环境干扰较大，而我国暂无相关的鉴别标准。市场上不同产地榴莲的价格差异较大，相比其他产地的榴莲，马来西亚榴莲在色泽、肉质与口感上优势较大，由于运输成本较高，因而在价格上显著高于其他产区，导致某些不良进口商家以假乱真，混淆榴莲产地以获得高额利润。目前马来西亚商务部门与我国开展了基于电子标签的溯源研究[7]。泰国、越南等榴莲出口国暂未报道榴莲的产地溯源研究和方案，因此，我国进口管理部门亟需开展榴莲产地溯源的方法，有利于解决我国榴莲产地造假的现象。

DNA指纹技术、气相色谱-质谱联用技术、近红外/拉曼光谱分析技术、稳定同位素技术以及元素指纹分析等都可用于产地溯源[8]。随着电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICPMS）技术的发展，元素指纹作为食品地理来源的判别指标显示出了较大的优势。其原理是环境中的水、地质和土壤环境中矿物元素经过溶解、沉淀、凝聚、络合、吸附等过程，形成具有不同迁移转化能力的矿物质，因而在不同地域生长的生物体有其各自的矿物元素指纹特征[9-12]。目前基于ICP-MS的元素指纹分析技术已在葡萄酒[13-17]、茶叶[9,18-21]、大米[22-23]中广泛应用。而在水果的产地溯源方面，已有文献报道了菠萝蜜[24]、柑橘[25]、柠檬[26]、苹果[27]和香蕉[28]的产地溯源。但目前的研究多针对单品种和小尺度的产地区分，元素指纹是否适用于多品种以及大尺度的榴莲产地溯源值得研究。除分析技术外，化学计量学也是食品产地溯源的必要手段。常见主要有基于非监督的主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚类分析技术以及基于监督的判别分析等方法[29]，随着机器学习算法的兴起，决策树、支持向量机、随机森林和BP人工神经网络的应用越来越普遍，且显示出巨大的优势[20]。

目前对榴莲产地真实性的研究较少，Siew等[30]从DNA指纹图谱角度利用简单重复序列技术区分马来西亚榴莲，但该方法也无法实现国际间产地区分，国内也未见对进口榴莲产地甄别的报道。因此，本研究旨在探讨基于元素指纹和化学计量学分析（PCA、Fisher逐步判别分析及BP人工神经网络）实现对主要榴莲出口国（马来西亚、泰国、柬埔寨和越南）的产地区分，以期帮助我国海关部门对进口榴莲真实性进行监管。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

依托深圳海关食品检验检疫技术中心平台，采集原产地为泰国、马来西亚、柬埔寨和越南4 个产区的新鲜带壳榴莲样品共计73 份，以上4 个产区均为出口榴莲的主要产区。具体采样信息如表1所示。

表1 4 个榴莲产区采样信息Table 1 Information about durian samples from four producing areas

65%浓硝酸（分析纯） 德国默克公司；超纯水（电阻率＞18.2 MΩ·cm，20 ℃）；含有28 种元素的多元素贮备液（1 000 μg/mL）、Rh内标元素储备液（1 000 μg/mL）和含有Ba、Be、Ce、Co、Li、Mg、Rh、U的调谐液（10 μg/mL） 美国珀金埃尔默仪器公司；氩气（Ar，纯度99.995%） 美国Air Products公司。

1.2 仪器与设备

8800系列ICP-MS仪 美国安捷伦公司；AG204型电子天平 美国梅特勒-托利多公司；MARSXPress微波消解仪 美国CEM公司；DEENAII系列全自动石墨消解仪美国Thomas Cain公司；Million-Q Integral型超纯水系统德国默克公司；JYL-C022E匀浆机 中国九阳集团。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

选取完整的新鲜榴莲，取榴莲果肉用高速粉碎机打匀均质，榴莲果核用超纯水洗净后晾干，用高速粉碎机打匀均质，待测。

1.3.2 样品消解及元素含量测定

参考GB 5009.268—2016《食品中多元素检测》[31]方法，准确称取1.0 g鲜样（精确至0.001 g）于泡过10%硝酸溶液[13]（避免交叉污染）的聚四氟乙烯消解管中，加入6 mL浓硝酸，置通风橱过夜；次日放入微波消解仪中消解；消解完毕后用超纯水冲洗内盖；然后置于135 ℃的全自动石墨消解仪中赶酸约0.5 h，冷却至室温后转移定容至25 mL，定容后的样液过孔径为0.45 μm水相滤膜后待用。同时做空白实验。

利用ICP-MS测定样品中的Li、Be、Na、Mg、Al、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Sr、Ag、Cd、In、Cs、Ba、Tl、Pb、Bi和U 28 种矿物质元素含量。

1.4 数据处理

采用SPSS 23.0软件对不同产地榴莲的矿物元素进行方差分析、Fisher逐步判别分析及BP人工神经网络分析，采用MATLAB R2 018a软件进行PCA，采用OriginPro 2018（Originlab，美国）软件图形绘制。

2 结果与分析

2.1 不同产区榴莲果核与果肉矿物元素含量差异分析

如表2所示，所有榴莲样品中Mg、Rb、Ca、Fe含量均较高，果核及果肉平均值分别为1 283.959、14.852、100.179、10.878 mg/kg和251.820、13.736、10.606、3.997 mg/kg，Li、Be、V含量较低，果核及果肉平均值分别为4.057、0.793、1.381 μg/kg和1.657、0.523、1.15 μg/kg。In、Ga、Bi、U和Be部分未检出。通过对泰国、马来西亚、柬埔寨和越南榴莲中果肉与果核的28 种元素含量进行方差分析，结果表明榴莲果核中Li、Be、Na、Mg、Al、V、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Rb、Ag、Cd和Tl 16 种矿物元素在4 个产地间存在显著差异（P＜0.05）（表2），榴莲果肉中Li、Be、Na、Mg、Al、Mn、Zn、Rb、Sr、Ag、Cd、Ba和Tl 13 种矿物元素在4 个产地间存在显著差异（P＜0.05）（表2），其余元素含量差异不显著。马来西亚榴莲果核中Li、Al、V、Co和果肉中Mg、Al、Zn、Sr含量高于其他3 个产区，果核和果肉中的Ag含量显著低于其他3 个产区；泰国榴莲果核中Mg、Mn和果肉中Cd含量显著高于其他3 个产区，果核中Co、As、Tl和果肉中As、Se、Tl含量较低；柬埔寨榴莲果核和果肉中Ag含量高于其他3 个产区，果核中Be、Al、As和果肉中Mg、Al、Mn、Sr含量较低；越南榴莲果核中Be、As、Rb和果肉中Rb、Ag、Ba含量高于其他3 个产区，果核中Li、Na、V、Ni、Cd和果肉中Li、Be、Mg、Zn、Cd含量较低。综上，不同产区的榴莲果核及果肉元素组成及含量都有各自组成特征，适用于榴莲产地的判别，但数据冗杂，还需进行化学计量学分析。

表2 马来西亚、泰国、柬埔寨和越南榴莲矿物元素含量差异分析Table 2 Mineral element contents in durian from Malaysia, Thailand, Cambodia and Vietnam μg/kg

2.2 不同产区榴莲果核与果肉矿物元素含量PCA

PCA可通过线性转换对大量数据进行压缩，以便进行数据降维[32]。将榴莲果核中存在显著差异的16 种矿物元素含量和及果肉中存在显著差异的13 种矿物元素含量进行PCA，结果如表3所示。PC1方差贡献率为27.447%，PC2方差贡献率为18.874%，PC3方差贡献率为12.580%，PC4方差贡献率为10.475%，PC5方差贡献率为8.055%，PC6方差贡献率为7.775%，前6 个PC的累计方差贡献率为85.207%，涵盖了榴莲中矿物元素的主要信息，减少数据分析复杂性。结合PC得分图分析，果核的Cu、Ni、Mg、Rb和Zn对PC1贡献最大，果肉的Ag、Zn、Tl和果核的Tl对PC2贡献最大，果肉的Ag、Zn和果核的As、Rb对PC3贡献最大，将PC1、PC2、PC3绘制三维散点图（图1），结果显示PCA可将马来西亚、泰国、柬埔寨和越南进行较好区分。由于前3 个PC的累计方差贡献率仅为58.901%，且地理上看泰国和柬埔寨产区较为接近，土壤环境较为类似，导致元素差异较小，因此图1显示泰国和柬埔寨有一定重叠。

图1 4 个产地榴莲中果核和果肉矿物元素的前3 个PC散点图Fig.1 Three-dimensional scattering plots of first three principal components for mineral elements in durian stone and flesh from four growing areas

表3 4 个产地果核与果肉中矿物元素PC的方差贡献率及载荷矩阵Table 3 Variance contribution rates and loading matrixes of principal components for mineral elements in durian stone and flesh from four growing areas

续表3

2.3 Fisher逐步判别分析和BP人工神经网络用于榴莲产地判别

为了进一步了解榴莲果核和果肉中矿物元素含量指标对4 个产地榴莲的产地判别作用效果，分别采用Fisher逐步判别分析和BP人工神经网络构建产地判别模型。将果核中16 种矿物元素（Li、Be、Na、Mg、Al、V、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Rb、Ag、Cd和Tl）和果肉中13 种矿物元素（Li、Be、Na、Mg、Al、Mn、Zn、Rb、Sr、Ag、Cd、Ba和Tl）引入判别模型中，筛选重要的建模变量。Fisher逐步判别分析结果显示29 种矿物元素含量指标中果核Li、Be、Mg、Mn、Rb元素和果肉Be、Ag、Ba元素对产地判别效果显著，先后被引入到判别方程中，且引入顺序为Li果核、Be果核、Ag果肉、Mg果核、Be果肉、Ba果肉、Rb果核、Mn果核，代表这8 项指标对判别函数贡献率大小，建立的榴莲产地判别函数如下：

Y马来西亚=1.049Li果核－0.618Be果核+0.000 005 47Mg果核+0.001Mn果核+0.784Be果肉+0.217Ag果肉+0.007Ba果肉－15.983

Y泰国=－0.533Li果核+3.974Be果核+0.000 015 2Mg果核+0.001Mn果核－0.000 010 5Rb果核－1.431Be果肉+0.791Ag果肉－23.036

Y柬埔寨=－0.46Li果核+3.245Be果核+0.000 014 7Mg果核－0.000 016 4Rb果核－0.302Be果肉+1.015Ag果肉－0.001Ba果肉－21.476

Y越南=－1.319Li果核+13.185Be果核+0.000 020 5Mg果核+0.000 062 4Mn果核－5.043Be果肉+1.373Ag果肉－50.372

式中：Li果核、Be果核、Mg果核、Mn果核、Rb果核、Be果肉、Ag果肉、Ba果肉分别为果核Li、Be、Mg、Mn、Rb和果肉Be、Ag、Ba的矿物元素含量/（μg/kg）；Y马来西亚、Y泰国、Y柬埔寨、Y越南分别为马来西亚、泰国、柬埔寨、越南的矿物元素含量/（μg/kg）。

在实际应用中，依据所建立的判别模型，可对上述4 个产地的榴莲盲样进行判别分类，将实验测得的各样品Li果核、Be果核、Mg果核、Mn果核、Rb果核、Be果肉、Ag果肉、Ba果肉代入上述4 个模型，而盲样则归属于Y值最大的地区。

将此判别模型对榴莲样品进行产地归类并结合留一交叉检验法对模型的有效性进行验证，结果如表4所示，在初始验证结果中，柬埔寨和越南榴莲全部被正确归类，初始判别准确率为100%；1 个马来西亚榴莲被误判到柬埔寨榴莲中，初始判别准确率为95.8%；泰国榴莲5 个被误判至柬埔寨，初始判别准确率为80%。在交叉验证结果中，泰国、马来西亚和越南验证结果与初始验证结果一致，1 个柬埔寨榴莲被误判至泰国榴莲中。综上，基于Fisher逐步判别分析的榴莲产地初始判别准确率为91.8%，交叉验证判别准确率为90.4%，可以实现大部分榴莲的产地甄别。将榴莲样品的前3 个判别函数得分作散点图（图2），可以直观地看出不同产地来源的榴莲有各自的空间分布特征，泰国和柬埔寨有部分交叉。将榴莲果核中16 种矿物元素（Li、Be、Na、Mg、Al、V、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Rb、Ag、Cd和Tl）代入判别模型中，判别方程的初始验证准确率为84.9%，交叉验证准确率为80.8%；将榴莲果肉中13 种矿物元素（Li、Be、Na、Mg、Al、Mn、Zn、Rb、Sr、Ag、Cd、Ba和Tl）代入判别模型中，判别方程的初始验证准确率为80.8%，交叉验证准确率为75.3%，由此可见，榴莲果肉和果核耦合指标大大增加了榴莲产地判别准确率。

表4 4 个产地榴莲Fisher逐步判别分析和BP人工神经网络结果Table 4 Results of Fisher stepwise discrimination and artificial neural network for mineral elements in durian from four different countries%

图2 4 个产地榴莲样品前3 个判别函数得分图Fig.2 Scattering plots of top three discriminant functions for durian samples from four growing areas

BP人工神经网络模型已经应用于多种食品的产地判别应用中[17]。本研究采用70%的样本进行建模，30%的样本进行验证，结果如表4所示。在训练验证结果中，马来西亚、柬埔寨和越南榴莲全部被正确归类，训练验证准确率为100%，2 个泰国榴莲被误判到柬埔寨榴莲中，训练验证准确率为86.7%；在检验验证结果中，马来西亚、柬埔寨和越南验证结果与训练验证结果一致，1 个泰国榴莲被误判至柬埔寨榴莲中，检验验证准确率为90%。综上，基于BP人工神经网络模型的榴莲产地训练验证准确率为96.1%，检验验证准确率为95.5%。

3 讨 论

矿物元素是生物体内的基本组成成分，也是参与生物代谢的重要物质。生物自身不能合成矿物元素而必须从环境中摄取，不同生长环境中的土壤、大气和水成分的差异会导致不同地域的植物矿物元素组成成分与含量差异，因此可利用特征性差异分析农产品产地溯源研究[33]。本研究采用ICP-MS法得到4 个榴莲主产区的果核及果肉矿物元素指纹图谱信息，结果显示结合化学计量学方法能够较好的表征产地特征。不同产地及品种的榴莲矿物元素种类基本一致，但是含量存在显著差异。总结前人实验发现，Ca、Mn、Cu、Co、Rb、Sr、Zn、Ba等元素在产地上存在明显分布特征，Fragni等[34]发现Ca、Mn、Co和Sr元素可以显著区分意大利、西班牙的番茄样品，Li、Ca、Cu和Pb元素可以显著区分意大利和非意大利（中国、美国和西班牙）的番茄。Mahne等[35]发现Ca、Mn、Fe、Zn、Br、Rb、Sr元素对莴苣、甜椒和番茄在产地上（斯洛文尼亚、奥地利、西班牙、摩洛哥、意大利、希腊）存在显著差异。此外，不同元素对产地、品种、土壤类型的贡献效果也有区别。Garcia等[36]发现Sr、Ba、Ni、Cu对葡萄酒产地贡献率大，而Sr、Ca、Mg、Mn对品种的区分效果更好。本研究发现As、Ag、Al、Rb、Be、Sr是指示榴莲产地正态化重要性中高于60%的元素（图3），同时可知榴莲果核元素含量在榴莲的产地判别上贡献较果肉大，未来可着重分析果核中的指纹特征分布对榴莲产地判别的影响。

图3 人工网络模型榴莲果核和果肉元素含量重要性柱状图Fig.3 Normalized importance of mineral elements in durian stone and pulp predicted by artificial network model

不同产地的榴莲元素含量的差异可能是由多种因素引起，首先是植物吸收土壤元素的有效性，植物吸收的利用效率主要与土壤阳离子交换能力有关，而土壤阳离子交换能力由土壤类型、pH值和矿物基质组成[37]决定。马来西亚、泰国、柬埔寨和越南虽然都是东南亚国家，但是习惯上把热带雨林气候的马来西亚称为“海洋国家”，把热带季风气候的泰国、柬埔寨和越南称为“半岛国家”[38]。泰国、柬埔寨和越南形成的中南半岛地形较高，出露岩石以花岗岩、片麻岩和石灰岩为主，土壤主要组成为强淋溶土，肥力较低，土壤呈酸性[39]；马来群岛沿海有狭窄平原，且地壳活动不稳定，火山地震活动强烈，喷出的火山灰致使马来半岛土壤肥沃，土壤类型主要以火成岩和黏土为主。气候与地形条件的差异可能导致马来西亚榴莲多个元素（果核中Li、Na、Al、V、Co、Ni、Cu、Zn、Tl和果肉中Li、Be、Mg、Al、Mn、Zn、Sr、Ba）含量显著高于其他3 个产区。此外，农业类型、施肥、人工灌溉、采摘年份与季节、果实成熟阶段均会影响微量元素的浓度。Tanabe等[40]比较了美国不同商业葡萄园中2015年及2017年生产的葡萄酒中62 种元素含量，发现元素含量在不同产区及采集年份均存在显著差异。Lim等[41]通过3 a的监测，发现榴莲叶片和土壤养分元素水平的波动与作物物候学的季节变化密切相关，榴莲叶片的Zn、Mn、Cu、Fe元素含量和土壤的K、Ca、Mg元素含量随榴莲果实的成熟而降低。因此元素含量指纹可从气候，土壤以及种植模式等多方面提供溯源能力。

本实验使用的Fisher逐步判别分析与BP人工神经网络分析中，发现交叉验证与检验验证中泰国榴莲误判率较高（准确率分别为80%和90%），且均误判为柬埔寨榴莲。可能原因是泰国样品较为分散，且2 个产区地理位置相邻有关。基于元素指纹特征，结合Fisher逐步判别分析与BP人工神经网络，本研究对4 个产区榴莲产地判别的总体准确率可达91.8%和96.1%，为东南亚榴莲的产地溯源提供了初步参考。为了大规模实现东南亚榴莲产地的准确甄别，未来实验应增加实验样本，着重从品种、成熟度、种植条件等多方面考虑，结合多种溯源指标进行耦合（光谱指纹特征、同位素指纹、DNA指纹等），构建多层次的榴莲产地溯源，为我国榴莲进口的产地甄别提供理论依据与技术支持。

4 结 论

本研究通过分析马来西亚、泰国、柬埔寨和越南4 个产地中不同品种的榴莲中果核和果肉的28 种矿物元素含量，提取了榴莲果核中存在显著差异的16 种元素（Li、Be、Na、Mg、Al、V、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Rb、Ag、Cd和Tl）和榴莲果肉中存在显著差异的13 种元素（Li、Be、Na、Mg、Al、Mn、Zn、Rb、Sr、Ag、Cd、Ba和Tl），对上述指标进行PCA，结果发现4 个产区的榴莲各自分布，泰国和柬埔寨榴莲有部分重叠。通过Fisher逐步判别分析实现了对榴莲产地的有效甄别，特征溯源指标为榴莲果核中的Li、Be、Mg、Mn、Rb 5 种元素与榴莲果肉中的Be、Ag、Ba 3 种元素，构建出的判别模型对榴莲产地判别的初始验证准确率为91.8%，交叉验证准确率为90.4%。利用BP人工神经网络技术，70%样本为训练集，30%样本为验证集，实现了榴莲产地的有效区分，榴莲果核As、Ag、Al、Rb和果肉中Ag元素为BP人工神经网络前5重要性元素，模型训练验证准确率为96.1%，检验验证准确率为95.5%。不同判别模型得出较为一致的结果，表明该方法稳定可靠。通过以上技术基本实现了马来西亚、泰国、柬埔寨和越南榴莲的区分，表明矿物元素指纹分析结合多元统计分析方法对甄别榴莲产地溯源的可行性，为进一步分析榴莲产地溯源提供有利条件。