岩藻多糖对Aβ25-35 诱导神经元凋亡和突起萎缩的抑制作用

杨志友，马智慧，张永平，宋 采，胡雪琼

（1.广东海洋大学食品科技学院//广东省水产品加工与安全重点实验室//广东省海洋生物制品工程实验室//广东省海洋食品工程技术研究中心//水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江，524088；2.大连工业大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连，116034）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种长期进行性的神经退行性疾病。目前我国约有1 000 万阿尔茨海默病患者，居世界首位，同时我国也是全球新发病例增速最快的国家之一。现在临床上用于治疗阿尔茨海默病的药物如胆碱酯酶抑制剂rivastigmine 和NMDA 受体抑制剂memantine属于对症疗法，并不足以改善患者的记忆功能，且伴随着严重的副作用[1-2]。Aβ 老人斑和神经原纤维缠结是阿尔茨海默病的两大病理学特征[3]，Aβ 级联假说认为神经突起萎缩和突触丢失处于神经细胞死亡的上游并构成了AD 的病理学基础[4]。以Aβ和Tau 蛋白为作用靶点设计的药物Solanezumab[5]和TauRx0237[6]均在三期临床中以失败告终，这说明疾病的发生机制与药物的治疗作用机制可能是以不同的信号通路实现的。有研究表明，Aβ 会诱导突触丢失和轴突萎缩[7]，而轴突萎缩在阿尔茨海默病中启动并加速脑神经元细胞死亡，最终导致神经元网络的破坏和记忆丢失[8]。因此，促进突起再生和保护神经元进而重建受损的神经网络可能是AD 记忆修复的关键。

藻类是海洋生物活性物质的重要来源，目前已发现的海洋生物活性物质中约40%来自藻类[9]。海带（Laminaria japonica）是一种常用的药食同源藻类，其主要活性成分是海带岩藻多糖（Fucoidan）。海带岩藻多糖是一种富含岩藻糖的硫酸盐聚合物，具有广泛的药理学作用，如抗衰老[9]、抗炎症性肠病[10]、抗肿瘤[11]、提高免疫[12]、抗病毒[13]、改善Aβ1-40 诱导的记忆损伤[14]等，然而，是否具有改善Aβ 诱导的神经细胞损伤和神经突起再生的作用尚未见报道。因此，本研究从岩藻多糖抗神经损伤的角度出发，探讨其对Aβ 诱导的神经元凋亡的保护和突起再生的作用，以期为其对AD 的治疗提供理论和实验依据，也可为海藻来源多糖的药物研发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验试剂与细胞株 岩藻多糖（Fucoidan）购自上海源叶生物科技有限公司（S11142），SH-SY5Y 细胞购于中国科学院上海分院细胞库，胎牛血清 FBS（10270-106 ）、MEM 培养基（C11095500BT）、F12 培养基（C11765500BT）、DNase I/Trypsine抑制剂（18047-019 和17075-011）、0.05% 和 0.25% Trypsin-EDTA（25300-054 和25200-072）、马血清（26050-088）购于美国Gibco公司。一次抗体β3-tubulin（sc-80005）购于SantaCruz公司，一次抗体MAP2 和荧光488/594 nm 标记的山羊抗兔/鼠二次抗体购于Abcam 公司。

1.1.2仪器和设备 酶标仪、自动细胞计数仪，Bioteck 仪器公司；倒置荧光显微镜，OLYMPUS IX73；二氧化碳恒温培养箱，美国Crystal 公司。

1.2 方法

1.2.1SH-SY5Y 细胞培养 SH-SY5Y 细胞培养采用MEM/F12 培养基（含体积分数15% FBS，100 U/L青霉素和100 μg/L 链霉素），于37 ℃、体积分数5% CO2的饱和湿度培养箱中生长，取对数生长期的细胞接种于培养板进行实验。

1.2.2小鼠大脑皮层原代神经元培养 胎鼠大脑皮层中神经元的分离方法参照前期研究[15]。简述如下，取怀孕14 d 的ICR 胎鼠大脑皮层，去掉硬脑膜，剪碎，加入质量分数0.05%的Trypsin-EDTA 于37 ℃消化15 min，用含质量分数0.6%葡萄糖、体积分数12%马血清和2 mmol/L L-谷氨酰胺的Neurobasal 培养基（HS 培养基）终止消化，然后加入600 U/mL DNase I 和0.3 mg/mL 的Trypsine 抑制剂，37 ℃孵育15 min，加入HS 培养基后，离心（90 g，3 min）去上清，用CMF-HBSS 缓冲液重悬、离心两次，将细胞重悬于HS 培养基中，过孔径0.45 μm 滤膜，将细胞接种于8 孔板中。

1.2.3岩藻多糖对SH-SY5Y 细胞毒性作用检测实验分为对照组（Cont）和岩藻多糖组（0.1、1.0、10.0、100.0 μg/mL 和1、5、10、20、30 mg/mL）。将SH-SY5Y 细胞接种于96 孔板中（5 × 104mL-1，100 μL），每组6 个复孔，培养24 h，用全反式维甲酸（RA）诱导神经分化6 d 后，加入0.1～ 30 000 μg/mL 的岩藻多糖，继续培养24 h。每孔加入CCK8（APExBIO，K1018）试剂10 μL，继续培养2 h，用酶标仪于450 nm 处测定光密度值。

1.2.4岩藻多糖对Aβ25-35 致SH-SY5Y 细胞损伤的作用 实验分为对照组（Cont）、模型组（Aβ25-35 20 μmol/L）和岩藻多糖组（0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 μg/mL）。将SH-SY5Y 细胞接种于96 孔板中（5 × 104mL-1，100 μL），每组6 个复孔，培养24 h，用全反式维甲酸（RA）诱导神经分化6 d 后，加入0.1～ 1 000 μg/mL 的岩藻多糖，1 h 后，每孔加入2 μL Aβ25-35（1 mmol/L）至终浓度为 20 μmol/L，37 ℃培养24 h 后，CCK8 法测定450 nm处光密度值。

1.2.5岩藻多糖对Aβ25-35 致原代小鼠大脑皮层神经细胞损伤的作用 实验分对照组（Cont）、模型组（Aβ25-35 10 μmol/L）和岩藻多糖组（0.01、0.10、0.50、1.00 mg/mL）。将原代皮层神经细胞接种于96 孔板（2 × 105mL-1，100 μL）中，每组5 个复孔，培养3 d 后，加入0.01～ 1.00 mg/mL 的岩藻多糖，1 h 后，加入Aβ25-35（10 μmol/L）处理24 h 后，用CCK8 法测定细胞存活率。

1.2.6岩藻多糖对Aβ25-35 致皮层神经突起萎缩的作用 原代皮层神经细胞接种于8 孔板（5 × 104mL-1，400 μL）中，培养3 d 后，加入不同质量浓度的岩藻多糖（0.1 和1.0 mg/mL），1 h 后，加入Aβ25-35（10 μmol/L），共培养3 d 后，弃去上清，质量分数4% 多聚甲醛（PFA）固定1 h，加入一次抗体β3-tubulin（突起染色）和MAP2（神经元胞体和树突染色）于4 ℃孵育12 h，然后加入激发波长594/488 nm 荧光探针标记的山羊抗鼠/兔二次抗体，DAPI 用于细胞核的染色。使用倒置荧光显微镜拍摄照片，每组拍摄10 张，用ImageJ（NIH）软件分析β3-tubulin 和MAP2 染色阳性的神经突起密度。

1.2.7岩藻多糖对正常皮层神经突起再生的作用 原代皮层神经细胞接种于8 孔板（4 × 104mL-1，400 μL）中，培养2 d 后，加入不同质量浓度的岩藻多糖（0.1和1.0 mg/mL），继续培养4 d，弃上清，分别用β3-tubulin 和MAP2 对细胞进行染色，DAPI 用于细胞核染色。用ImageJ 软件统计分析神经突起密度。

1.3 统计学分析

实验重复3 次，结果以平均值±SEM 表示。用ImageJ、GraphPad Prism 5.0 对数据进行统计学分析并制图。对于不符合正态分布的细胞存活率结果（图1-3），进行平方根反正弦转换后[16]，用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Dunnett 检验进行组间比较，P <0.05 被认为有显著的统计学差异。

2 结果与分析

2.1 岩藻多糖对SH-SY5Y 细胞毒性作用

图1 中，与对照组（Cont）相比，加入0.1～ 1 000 μg/mL 岩藻多糖组SH-SY5Y 细胞存活率无明显变化（P >0.05），随着岩藻多糖浓度的升高，5～30 mg/mL 岩藻多糖组显著降低SH-SY5Y 细胞存活率（P <0.05），说明高浓度岩藻多糖对细胞有一定毒性，因此选择0.1～ 1000.0 μg/mL 岩藻多糖进行后续实验。

图1 岩藻多糖对SH-SY5Y 细胞存活率的作用Fig.1 The effect of Fucoidan on SH-SY5Y cell survival rate

2.2 岩藻多糖对Aβ25-35 致SH-SY5Y 细胞损伤的保护作用

前期研究发现，20 μmol/L 的Aβ25-35 作用24 h可显著降低 SH-SY5Y 细胞存活率[17]，因此，SH-SY5Y 细胞系AD 模型用20 μmol/L Aβ25-35。0.1～1 000.0 μg/mL 岩藻多糖作用于细胞1 h 后，加入Aβ25-35 处理24 h。与对照组（Cont）相比，模型组（Veh）细胞存活率显著降低（P <0.001），而与模型组相比，岩藻多糖10～ 1 000 μg/mL 组细胞存活率显著升高（P <0.05），且有浓度依赖性。表明岩藻多糖可抑制Aβ25-35 诱导的SH-SY5Y 细胞损伤（图2）。

图2 岩藻多糖抑制Aβ25-35 诱导的SH-SY5Y 细胞凋亡Fig.2 Fucoidan inhibits Aβ25-35 induced SH-SY5Y cell apoptosis

2.3 岩藻多糖对Aβ25-35 致小鼠原代皮层神经元损伤的保护作用

本课题组前期研究发现[15]，10 μmol/L 的Aβ25-35 作用于神经元3 d 后，细胞存活率显著降低，与对照组相比差异显著（P <0.05）。岩藻多糖预处理1 h 后与Aβ25-35 共培养3 d，结果发现，0.1、0.5 和1.0 mg/mL 的岩藻多糖组细胞存活率明显升高（P <0.01），表明岩藻多糖能够抑制Aβ25-35 诱导的原代神经元损伤（图3）。

2.4 岩藻多糖对Aβ25-35 致小鼠原代皮层神经元突起萎缩的抑制作用

通过构建Aβ25-35 诱导的神经元突起萎缩模型，探讨岩藻多糖对神经突起萎缩的抑制作用，结果见图4。结果显示，与对照组（Cont）相比，10 μmol/L 的 Aβ25-35 显著降低 β3-微管蛋白（β3-tubulin）阳性的突起密度（P <0.001）。与模型组（Veh）相比，0.1 和1 mg/mL 的岩藻多糖组均能显著增加突起密度（P <0.001），表明岩藻多糖可以抑制Aβ25-35 诱导的原代神经元突起萎缩。

图4 岩藻多糖改善Aβ25-35 诱导的原代皮层神经元突起萎缩Fig.4 Fucoidan ameliorates Aβ25-35 induced primary cortical neurites atrophy

续图4（Continued）

2.5 岩藻多糖对正常原代皮层神经元突起再生的作用

为探讨岩藻多糖改善Aβ25-35 诱导的原代皮层神经元突起萎缩的作用是源于对Aβ 的抑制作用还是对神经元突起的再生作用，测定岩藻多糖对正常培养的神经元突起再生的作用（图5）。免疫荧光染色结果表明，与对照组相比，岩藻多糖0.1 和1.0 mg/mL 组能显著增加β3-tubulin 阳性染色的突起密度（P <0.01）。结果说明岩藻多糖具有促进神经元突起再生的作用。

图5 岩藻多糖对正常培养的原代皮层神经元突起的再生作用Fig.5 Effect of Fucoidan on normal cultured primary cortical neurites regrowth

3 讨论

Aβ 老人斑和神经元纤维缠结是AD 的两大病理性特征。有研究表明，Aβ 寡聚体能够加速Tau蛋白的磷酸化，促进神经突起解聚和萎缩，增大钙离子内流，最终促进神经元的死亡[7]。神经元的大量死亡造成神经元之间的网络联结破坏，信息在神经元间的传递终止，造成大脑对信息存储、保持和再现功能破坏，从而导致记忆损伤[8]。因此，通过促进萎缩的神经元突起再生，进一步整合到已有的神经元网络可能是改善记忆的关键。本课题组前期研究结果也表明，一些促进轴突或树突再生的化合物能够明显增强正常小鼠的认知和空间记忆能力[15]。本研究发现，岩藻多糖能够显著抑制Aβ 诱导的神经细胞凋亡，表明其具有很好的神经保护作用。同时，岩藻多糖能够促进正常神经元突起的再生，提示其改善记忆的作用也可能是通过重新构建破环的神经元局部回路与神经网络实现的。

海带中岩藻多糖一般为硫酸酯化多糖，分子质量和极性都相对较大，血脑屏障的透过性是保证其直接作用于大脑神经元的关键。有研究表明[18]，利用平行人工膜渗透试验（PAMPA）发现岩藻多糖的分子透过率值为10.4 × 10-6cm•s-1，推测其具有优良的血脑屏障穿透性。Xu 等[19]利用Caco-2 细胞模型，将FITC 荧光标记物嵌合到岩藻多糖分子中，发现岩藻多糖膜透过性良好，其在细胞膜上的转运作用是通过网格蛋白介导的内吞作用实现的，提示其可能具有透过血脑屏障的能力，但进一步研究发现岩藻多糖吸收后快速在肾脏和肝脏中富集，在脑和心脏中未检测到岩藻多糖存在。甘露寡糖二酸（GV-971）是从海藻中提取的海洋寡糖类分子，在2019 年被国家药品监督管理局批准有条件上市，用于治疗轻至中度阿尔茨海默病。研究表明，GV971能在葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）的作用下透过血脑屏障，解聚Aβ 聚合体并抑制Aβ 寡聚体形成，同时还通过调节肠道菌群失衡、重塑机体免疫稳态，进而降低脑内神经炎症，多靶点阻止AD 病程进展[20]。黄娟等[21]发现高分子质量的岩藻多糖可以调控小鼠肠道菌群并修复环磷酰胺诱导的小鼠免疫功能。因此，岩藻多糖是否也是通过GLUT1 透过血脑屏障直接作用于神经元并通过调控肠道菌群等多靶点改善记忆尚需进一步验证。

本研究通过建立AD 体外细胞损伤模型，首次发现岩藻多糖对Aβ25-35 诱导的原代皮层神经元的损伤具有保护作用，且对其诱导的神经突起萎缩具有再生作用。而岩藻多糖促进神经再生和神经元保护的作用靶点和作用机制有待进一步的研究。研究发现，岩藻多糖可以减少转基因AD 秀丽线虫中Aβ的积聚和 ROS 的产生，从而改善线虫（Caenorhabditis elegans）的运动行为[22]。Zhang等[23]发现岩藻多糖可以通过抑制溶酶体组织蛋白D 的活性而抑制H2O2诱导的PC12 细胞凋亡，Wei等[24]发现岩藻多糖可以抑制PC12 细胞凋亡并改善AD 小鼠的记忆障碍，其作用机制可能与胆碱能系统调节、减少氧化应激和抑制Caspase 凋亡通路有关。岩藻多糖的分子结构较为复杂，硫酸基取代和岩藻糖支链连接方式多样，给揭示其抗AD 和神经元保护的作用机制带来困难，因此，在后续研究中通过对岩藻多糖进行纯化和结构鉴定，得到结构和分子量均一的岩藻多糖，将有助于阐明其对神经元突起再生和AD 记忆改善的作用机制。

4 结论

岩藻多糖可有效抑制Aβ诱导的SH-SY5Y细胞和原代皮层神经元凋亡，抑制Aβ 诱导的突起萎缩并促进神经突起再生。