肠道菌群促进肝癌发生的机制及其临床应用

付豪爽 赵爽 谢青

肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是全球肿瘤死亡的第三大原因，大多发生于慢性肝病患者中，可以由病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD[1])和酒精性脂肪肝引起。微生物群可以调节代谢、炎症和免疫，在维持健康和疾病发生、发展中发挥重要作用。现有证据显示，微生物群在肿瘤发生与抗肿瘤免疫反应中发挥关键作用。本文就肠道菌群在小鼠模型和HCC患者中促进HCC发生和发展的机制的研究进展进行综述，包括生态失调、肠道屏障的破坏和细菌代谢物的作用。此外，本文还回顾了近年来肠道菌群作为HCC患者潜在诊断工具以及免疫治疗新靶点的最新进展。

一、肠道菌群与肝癌

微生物存在于人体表面及肠道中，而有效屏障的存在可以阻止微生物入侵人体。这些机制允许人类在代谢、免疫和避免感染等许多方面受益于微生物群。尽管肝脏与微生物群并无直接接触，但它与肠道有着紧密的解剖联系。虽然有肠道屏障的存在，但营养丰富的血液从肠道到肝脏的循环还伴随着肠道菌群衍生的代谢产物的低度暴露，称其为微生物相关分子模式(microbiota-associated molecular patterns，MAMPs)。

慢性肝病(Chronic liver disease，CLD)与肠道菌群的紊乱有关，称之为生态失调[1]。此外，肠道屏障的改变导致菌群易位，使CLD患者的肝脏暴露于MAMPs和细菌代谢物。有证据表明，肠道菌群在CLD进展和HCC发生发展中具有重要作用[1-2]。与此同时，微生物群在调节抗肿瘤免疫反应中发挥关键作用[1-2]。因此,微生物群具有双重作用，既促进CLD条件下的肿瘤进展，又具有抗肿瘤的积极作用。

二、肠道屏障破坏和生态失调在CLD进展和HCC发生发展中的作用

大多数肝细胞癌发生在肝硬化患者中。在CLD的早期就已观察到菌群易位和生态失调，这促进了炎症、纤维化形成和肝硬化的进展[1,2]。因此，肠道屏障破坏和生态失调是CLD各阶段的显著特征，并促进其逐步发展为HCC(图1)。

(一)肠道屏障破坏 导致肠道屏障破坏的机制是多方面的。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，通过Toll样受体4(TLR4)引发炎症，是MAMPs易位最常用的标记物，门脉LPS水平在CLD发展过程中逐渐升高,在Child-Pugh C级肝硬化患者中达最高；同样，细菌DNA水平作为TLR9的激动剂，也在CLD发展过程中逐渐升高[3]。这些发现表明，慢性损伤的肝脏容易暴露于大量TLR配体以及其他细菌代谢物中。

(二)生态失调 现有研究表明，肝硬化[4-6]和HCC患者[5-7]均存在生态失调。最近一项研究发现了生态失调在CLD中的重要作用，通过16S测序研究过去十年中几个主要与生态失调相关的疾病的肠道菌群，包括肝硬化、结肠直肠癌、肥胖和2型糖尿病[4]。该研究表明，肠道菌群变化最能准确预测的疾病便是肝硬化[4]。此外，虽然健康人和肝硬化患者之间的肠道菌群差异最明显[4,8]，但有证据表明，肝硬化和HCC患者之间亦存在差异[5-7]。一项研究检测了慢性HBV感染导致的肝硬化和HCC患者的微生物多样性[6]，发现从健康人到肝硬化，粪便菌群多样性降低；但从肝硬化到早期HCC合并肝硬化，粪便菌群多样性增加，同时鉴定出30种微生物标志物并发现放线菌增加，疣状杆菌减少[6]。而在另一项非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)肝硬化患者的研究发现，与NASH无HCC的肝硬化相比，HCC患者多形杆状菌和疣微菌科明显增加，这些肠道微生物分布与钙保护素浓度和全身炎症相关。比较HBV相关HCC和非HBV非HCV(non-HBV non-HCV，NBNC)相关HCC患者的肠道微生物群研究中发现，HBV相关HCC患者粪便微生物区系丰度远高于健康对照组和非HBV非HCV相关HCC患者，NBNC相关HCC患者的粪便含有更多潜在的促炎细菌(大肠杆菌、肠球菌)和低水平的粪杆菌、瘤胃球菌和瘤胃梭菌，导致抗炎短链脂肪酸水平下降。总之，HCC微生物谱的变化在不同研究中并不一致，可能是由于病因、地区及营养摄入不同所致。但肝硬化患者与HCC患者之间的差异，以及单纯肝硬化患者之间的差异少于健康人与肝硬化患者之间的差异。因此,相比HCC诊断，针对肝硬化的以微生物群为基础的诊断检测可能会更有效。而微生物群对于HCC发生的影响可能主要与肝硬化改变有关而非特定的HCC相关变化。

三、微生物群在肝脏肿瘤发生中的作用

(一)HCC 迄今为止，所有关于肠道菌群在HCC发生中作用的证据都是基于对小鼠的研究，暂无临床研究证明特定微生物特征与HCC风险的相关性。在一项小鼠实验中证明，微生物群及其激活的信号通路促进了HCC的发展。在使用不同方式诱导HCC的模型小鼠中，进行肠道灭菌或者使用无菌小鼠建模，所诱导的HCC信号通路的激活均大大降低；而用微生物衍生的MAMPs或代谢物处理或通过右旋糖苷硫酸钠破坏肠道屏障，增加全身LPS水平，可促进小鼠肝纤维化和HCC的发生发展[9-12]。

(二)其他肝脏肿瘤 关于肠道菌群在胆管癌中作用的数据目前仍十分有限。在一项研究中，使用16S测序对60名胆管癌患者的肿瘤样本进行分析。发现在胆管组织中存在以假单胞菌科和草杆菌科为主的具有组织特异性的菌群[13]。同样，关于肠道菌群在肿瘤转移中的作用的数据也较少。来自两个独立课题组的研究发现在抗生素处理的小鼠中免疫介导的转移减少[14,15]。

四、相关机制和信号通路

(一)通过MAMPs和TLRs促进炎症、纤维化和再生，导致肿瘤发生 CLD的肠道屏障破坏导致循环中高水平的MAMPs 如LPS,从而通过多种机制促进CLD进展和HCC发生。二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)和DEN +四氯化碳(carbon tetrachloride，CCL4)处理的小鼠模型发现，细菌易位可以导致LPS及其受体TLR4表达，继而诱导HCC形成[9,16]；在7,12-二甲基苯并蒽(7,12-dimethylbenz[a]anthracene，DMBA)+高脂饮食处理的小鼠中，细菌易位可上调脂磷壁酸及其受体TLR2表达，继而导致慢性炎症状态，促进HCC形成[17]。TLR4介导的HCC发生经由肝常驻细胞介导，除了促进慢性炎症外，TLR4还可以促进肝纤维化，同时上调肝星状细胞中上皮调节蛋白的表达，上皮调节蛋白是肝细胞分裂原，可以促进HCC进展[9]。在单纯DEN诱导的无肝星状细胞活化和纤维化的HCC模型中，TLR4不仅促进了炎症基因的表达，而且还促进肿瘤的增殖，同时又防止其死亡。TLR2在脂肪肝相关的HCC中的作用主要由肝星状细胞介导，可以导致衰老相关表型(senescence associated phenotype，SASP)，而SASP可能是由次级胆汁酸去氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)以及肝星状细胞中的Cox2和前列腺素E共同介导[17]，提示这些介质一方面触发了促肿瘤炎症，另一方面前列腺素E还可通过对免疫细胞的免疫抑制作用促进HCC的发生。

(二)通过肠道微生物衍生代谢产物促进肿瘤进展 除了MAMPs外，生态失调还改变了肠道菌群的代谢途径。一项研究证实，高脂饮食的小鼠发生的主要变化是革兰氏阳性菌的积累，这增强了胆汁酸的转化能力[10]。次级胆汁酸如DCA可以上调脂磷壁酸及其受体TLR2在肝星状细胞中的表达，共同导致促肿瘤SASP[17]。肠道菌群依赖的胆汁酸代谢变化促进HCC生长的另一个机制是调节肝脏中CXCL16的表达，及其介导的自然杀伤T (NKT)细胞的募集[14]。用抗生素(抑制细菌转化次级胆汁酸)或胆固醇(封闭所有胆汁酸)处理小鼠的实验表明，初级胆汁酸可以上调肝血管内皮细胞CXCL16，继而导致NKT细胞的募集，NKT细胞又反过来以CD1d依赖的方式杀死肿瘤细胞。另一项研究以高胆固醇-高脂肪的NASH饮食方式作为诱发因素研究NASH导致的HCC，发现抗生素可以抑制HCC的发生，同时伴随次级胆汁酸的骤降[18]，次级胆汁酸如DCA激活了肝细胞的mTOR通路[18]。此外，短链脂肪酸是另一类细菌代谢物，由细菌发酵纤维和抗性淀粉产生。现有研究表明，高含菊粉饮食会促进肠道生态失调小鼠的HCC发生[19]。此外，有研究发现胆固醇可以通过减少胆汁酸从而降低短链脂肪酸的促肿瘤作用。肠道菌群产生的可能促进HCC发生的其他代谢物包括三甲胺(trimethylamine，TMA)及其代谢物三甲胺N氧化物(trimethylamine N-oxide，TMAO)和乙醇。TMA由膳食中的胆碱和肉碱经由肠道细菌代谢产生，经肠道吸收后在肝脏转化为TMAO。高水平的TMAO与胰岛素抵抗有关[20]，提示其可能导致NAFLD的进展，同时导致与NASH相关的HCC。此外，乙醇也不断经由肠道菌群产生并在NASH患者中增加。而乙醇不仅是一种肝毒素，也是一种已知的致癌物。但TMAO在NASH和肝癌发生中的作用，以及肠道菌群产生的内源性乙醇是否促进CLD和HCC的发生目前尚不清楚。

五、微生物群和免疫监视作用

现有研究表明，先天性和适应性免疫应答都可能促进HCC发生或抑制其发展[21](图2)。部分原因可能是HCC经常发生在慢性炎症的背景下，尽管免疫细胞是免疫监视的关键因子，但也可能通过促进炎症来诱导CLD中的HCC发生。此外，已有研究在注射DEN的小鼠中证明了B细胞和T细胞的肿瘤抑制作用。与之相反，有研究表明CD8+T细胞可能促进肝脏炎症从而导致NASH的发生[22]。肝脏免疫监视由不同的细胞群以特定的方式参与。在NASH的背景下，亦发现CD4+T细胞在HCC监测中的重要作用。研究证明，NASH可以导致亚油酸积累，继而导致活性氧介导的CD4+T细胞死亡，从而导致肿瘤生长加快[14]。无论是来自人类样本中原位分析B细胞和T细胞相互作用的数据，还是对小鼠的研究，都显示了B细胞在HCC的免疫监视中的作用，而CD4+调节性T细胞和髓系抑制细胞的积累则已被证明具有损害效应T细胞和NK细胞的作用。

图2 肠道微生态调控炎症和免疫监视

虽然有许多研究评估肠道菌群在HCC发生和发展中的作用，但肠道菌群影响肝脏免疫监视的机制尚不清楚。现有研究表明，肠道菌群和免疫系统之间存在着密切联系,其不仅调节肠内的局部免疫，而且对全身免疫也有调节作用[23]。而这种作用归因于MAMPs和细菌代谢物，如短链脂肪酸和胆汁酸[24]，这些分子通过TLRs、GPR41、GPR43等受体在免疫细胞中发挥免疫调节功能。此外，现有研究表明，肠道菌群控制了小鼠对HBV的免疫反应，从而导致在6周抗生素治疗后无法清除HBV[25]。由此可知，肠道菌群改变可能以正向或负向的方式调控具有HCC风险的患者的免疫监视功能。

六、微生物组作为HCC的筛查标志物和治疗靶点

(一)应用微生物组进行HCC筛查和诊断 大多数HCC患者确诊时已处于晚期。而肠道菌群可能是筛查早期HCC理想的生物标志物。最近一项研究对来自中国的75例HBV和HCV感染的HCC患者进行了研究，以评估微生物群作为HCC非侵入性生物标志物的潜力，其结果在另一项研究得到了验证[6]。如前所述，从肝硬化到HCC早期，粪便菌群的多样性增加，同时鉴定出30种微生物标记[6]。因而，肠道菌群作为生物标志物为早期诊断HCC提供了潜在的非侵入性工具。

(二)靶向微生物群预防肝癌 在动物研究中，微生物群在促进CLD和HCC的发生、发展中具有关键作用。因此，微生物群有可能成为预防HCC的一个新靶点。其中有多种方法可以考虑，包括抗生素、TLR拮抗剂以及细菌代谢产物抑制剂等[2]。另外对小鼠的研究表明，使用抗生素治疗可能会有效减缓进展期HCC的发展[9]。因此，随着研究的进展，或许可以将靶向肠道菌群作为肝硬化高危人群的一级预防，或作为HCC手术切除患者的二级预防策略。

(三)利用微生物群治疗HCC的免疫疗法 最近一些研究探讨了肠道菌群可能在调节免疫检查点抑制剂治疗反应中的重要作用。免疫检查点抑制剂针对T细胞表面的免疫调节分子或其配体，增强抗肿瘤免疫反应，并已被批准用于治疗HCC患者。然而，在非小细胞肺癌、肾细胞癌或尿路上皮癌患者中，抗生素的使用对免疫检查点阻断的应答存在负面影响[26]。与未使用抗生素的患者相比，在抗PD -1/PD-L1单克隆抗体治疗前、中、后的近期常规使用抗生素，患者的无进展生存期和总生存率显著降低。该发现与最近一项小鼠实验结果一致，将对免疫检查点阻断疗法有反应的肿瘤患者的粪便菌群移植到无菌小鼠体内，可以改善PD-1阻断的抗肿瘤效果；而来自无反应患者的粪便菌群则无该作用[26]。

由此可知，调节肠道菌群可能是当前抗肿瘤治疗的一个新靶点。鉴于HCC和肝硬化患者通常存在严重的肠道生态失调，可能导致某些患者的免疫治疗失败，因而调节肠道菌群对于HCC的作用可能比其他肿瘤更有意义。多个通过调整肠道微生物群治疗非HCC的癌症患者的临床试验已经开始，包括万古霉素联合免疫检查点抑制剂的一项临床试验正在进行中。但迄今为止，尚不清楚上述关于肠道菌群在小鼠和其他肿瘤类型患者的抗肿瘤免疫反应中的作用的研究结果是否也适用于HCC患者。

七、展望

在过去几年中，我们见证了肠道菌群在健康和疾病中的作用的知识爆炸。对肠道菌群的进一步了解有助于预防、诊断和治疗HCC。治疗可能通过促进抗肿瘤免疫直接或间接地发挥作用。当然，治疗策略并不限于免疫方法，也包括其他应用，如预防肿瘤恶病质，改善化疗引起的副作用或增强其疗效。另外，肠道菌群可能因地区、营养和生活方式的不同而具有显著差异，因此并不是所有的结论都是可概括的。未来的临床研究需要对样本采集、细菌裂解等进行标准化，以提高比较不同试验和临床中心的结果的能力[27]。综上所述，目前只是肠道菌群研究时代的开始，肝脏和肠道的紧密联系将为HCC患者的微生物预防、诊断或治疗提供更多思路和方向。