一株烟草疫霉菌拮抗菌的筛选及应用潜力初探

罗志威，林元山

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

烟草黑胫病（Tobacco black shank）又称烟草疫病，致病菌为烟草疫霉菌，俗称烂腰、黑根，多发于成株期，少数发生在苗床期，其发病率达到5%～20%，严重的达50%以上，我国平均每年因烟草黑胫病造成的经济损失达1亿元以上，仅次于烟草病毒病[1]。烟草疫霉菌的防治方法主要有农业防治（轮作、抗病品种选育[2]）、化学防治[3]（代森锰锌、恶霜灵、肉桂酰胺类杀菌剂氟吗啉、金雷多米尔锰锌）和生物防治[4-5]。农业防治法和化学防治法容易出现农药残留、产生抗药性，单一种植导致抗病品种退化、生态环境失衡等问题[6]。生物防治法具有安全有效、绿色环保的特点，应用前景广阔[7]。为此，笔者进行了烟草疫霉菌拮抗菌的筛选，以期从湖南省烟草种植区土壤中筛选具有烟草疫霉菌拮抗作用的功能菌，为烟草病害的生物防治提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 烟草疫霉菌 供试烟草疫霉菌由湖南农业大学烟草生物科学与工程技术中心提供。

1.1.2 培养基 （1）LB培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠10.0 g，琼脂粉20 g（仅固体培养基），蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.2。（2）PDA培养基：马铃薯去皮200 g，切碎煮沸30 min，200目筛过滤后定容到1 000 mL，然后加入20 g葡萄糖、20 g琼脂粉。（3）燕麦培养基：燕麦30 g，煮沸1 h后，纱布过滤定容到1 000 mL，然后加入20 g琼脂粉。（4）10% V8汁培养基：美国V8蔬菜汁100 mL与1 g碳酸钙混合均匀，3 000 r/min 离心后取上清液，加自来水定容到1 000 mL，pH自然值。（5）阿须贝无氮培养基：甘露醇10 g，CaCO35 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO40.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，NaCl 0.2 g，琼脂粉20 g，加自来水定容到1 000 mL。（6）解无机磷培养基：(NH4)2SO40.5 g，葡萄糖 2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.2 g，CaCO32.5 g，Ca3(PO4)210 g，MnSO40.02 g，FeSO40.02 g，琼脂粉20 g，pH值7.2，加自来水定容到1 000 mL。以上培养基均在121℃、0.1 MPa条件下灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤细菌的分离 从湖南省浏阳市北盛、淳口、洞阳等地采集烟草疫霉病发病严重烟田的健康植株根系5～10 cm处的土壤约400 g，分装标记带回。称取处理后的土样10 g，放入装有玻璃珠和100 mL无菌水的三角瓶中，160 r/min震荡30 min。将混合均匀的液体，逐级以10倍稀释，分别吸取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释液100 μL加到LB固体培养基平板上，涂布均匀，将培养皿转移至30℃的恒温培养箱中，倒置培养3 d。

1.2.2 拮抗细菌的筛选 将活化的烟草疫霉菌接种到PDA培养基上培养5 d，用直径6 mm打孔器打取生长良好菌饼，转接到PDA培养基的平板中央。采用平板对峙法将纯化后的细菌点接或划线在烟草疫霉菌饼对称位置，28℃下培养5 d左右，待对照皿中烟草疫霉病丝铺满培养皿时，测量菌落直径，按公式（1）计算抑制率。

1.2.3 拮抗细菌LZW-118的鉴定 将筛选获得的LZW-118菌株划线接种于LB固体培养基上，37℃培养48 h，观察菌落外观和形态，挑取菌落进行革兰氏染色，生理生化测定参照《常见细菌系统鉴定手册》进行。菌株16S rDNA 测序由华大基因公司完成，测序结果通过NCBI GenBank进行Blast序列同源性比对，使用MAGE 7.0软件构建系统发育树。

1.2.4 促生潜力初探 （1）解钾能力鉴定。将菌株接种至解钾培养基中，在30℃培养箱中培养7 d，观察是否有解钾圈。（2）解磷能力鉴定。将菌株接种至解磷培养基中，在30℃培养箱中培养7 d，观察是否有溶磷圈。（3）固氮能力鉴定。将菌株接种至阿须贝无氮培养基中，在30℃培养箱中培养7 d，观察菌株是否能生长。（4）盆栽试验。以K326为供试烟草品种。供试发酵液制备：将LZW-118菌株接种到LB培养基中，30℃下160 r/min培养96 h待用，调整发酵液浓度至2×108CFU/mL。供试烟草培育：采用漂浮育苗法培育烟草幼苗，30 d后将幼苗移在到盆栽中，栽培基质为草炭和珍珠岩按照重量比7∶3配制而成。盆栽试验处理：设3个处理，分别为清水对照处理（CK）、LB培养基处理（T1）、LZW-118发酵液处理（T2）。在烟草定植到盆栽3 d后进行初次灌根处理，每株20 mL（5 mL发酵液或LB培养基+15 mL清水混匀），7 d后进行第2次灌根处理，水肥管理参照GB/T 23221—2008 烤烟栽培技术规程进行。在团棵期测量烟草农艺性状，测量方法参照YC/T 142—2010。

1.2.5 拮抗菌发酵液对烟草疫霉菌的影响 挑取1环培养好的LZW-118菌株接种至LB液体培养基中，28℃、150 r/min条件下震荡培养96 h，10 000 r/min离心10 min收集上清液，经0.25 μm针孔滤膜过滤待用。采用管碟法[8]测定拮抗菌发酵液对烟草疫霉菌的影响。培养皿中放入牛津杯，将冷却至55℃的燕麦培养基倒入培养皿中，每皿约20 mL；培养基冷却凝固后取出牛津杯，用移液枪取10 μL燕麦培养基注入牛津杯孔封底；吸取接种至V8汁培养基培养7 d的烟草疫霉菌发酵液 0.1 mL至培养皿，均匀涂开；加入过滤好的LZW-118菌株上清液50 μL，以无菌水为对照，置于28℃培养箱培养5 d，按公式（2）计算抑制率。

2 结果与分析

2.1 不同菌株对烟草疫霉病的抑制效果

试验结果显示，从烟草植株根际土壤中共筛选出43株对烟草疫霉有拮抗作用的细菌，其中部分拮抗菌对烟草疫霉菌的抑制率62.16%～71.14%（表1），以LZW-118菌株的拮抗能力最强（图1），抑制率达71.14%。

表1 部分拮抗菌对烟草疫霉病的抑制率

图1 拮抗菌株对烟草疫霉病的抑制作用

2.2 菌株LZW-118的鉴定

2.2.1 菌株LZW-118形态学特征和生理生化特征 在LB固体培养基上，菌株LZW-118菌落成圆形、乳黄白色，凸起、边缘整齐，表面光滑湿润（图2C），革兰氏染色为阴性，细菌形态呈直杆状。结合拮抗菌株LZW-118生理生化特征（表2）和形态特征，初步判定LZW-118菌株属于伯克氏菌属。

表2 LZW-118菌生理生化特征

图2 ZW-118菌株在不同培养基中的菌落形态及溶磷作用

2.2.2 16S rDNA 序列分析与系统进化树 将获得的基因序列与NCBI数据库中己知序列进行对比，利用MEGA 7.0构建系统发育树，如图3所示，菌株LZW-118 与Burkholderia vietnamiensisstrainLMG 10929的序列同源性达到99.79%，且菌株LZW-118生理生化特征与越南伯克霍尔德氏菌基本一致。基于生物学特征及16S rDNA 序列分析，初步鉴定LZW-118为越南伯克霍尔德氏菌 （Burkholderia vietnamiensisstrainLZW-118）。

图3 基于 16S rDNA 序列构建的菌株LZW-118 系统发育

2.3 促生潜力初探

初步探索了LZW-118菌株的促生潜力，结果显示，拮抗菌LZW-118在解无机磷平板中形成溶磷圈（图2D），具有解无机磷功能；其在钾长石培养基中能生长，但是没有形成解钾圈；其在阿须贝无氮培养基中可以生长（图2E），可能具有固氮作用。由表3可知，施用拮抗菌LZW-118发酵液对烟草农艺性状有较好地促进效果；在株高方面，与CK相比较，T2处理烟草的株高、叶长、叶宽、茎围、叶片数均有显著提升，分别增加19.91%、15.49%、5.23%、3.09%、8.33%；T1与CK相比农艺性状略优，但相差不大。这表明LZW-118菌株有较大的促生潜力。

表3 不同处理对烟草农艺性状的影响

2.4 拮抗菌发酵液对烟草疫霉菌的影响

由图4可知，LZW-118菌株发酵液上清对烟草疫霉菌有较强的抑制作用，抑制率达到80.07%，表明发酵液中含有某种物质可以抑制烟草疫霉菌的生长。

图4 LZW-118菌株发酵液对烟草疫霉菌的拮抗作用

3 小结与讨论

研究结果表明，从烟草根际筛选的LZW-118菌株为越南伯克霍尔德氏菌，对烟草疫霉的抑制作用显著，同时兼具溶磷固氮功能，可显著提高烟草株高、叶长、叶片数等农艺性状，具有较好的应用前景。有研究表明，越南伯克霍尔德氏菌对多种土传病菌具有较强的抑制能力，并且具有良好的促进植物生长功能。胡雪[9]筛选的越南伯克霍尔德氏菌PH2具有较好的溶磷作用，对水稻稻瘟病和纹枯病病原菌具有较好的抑制作用。李萍等[10]筛选的越南伯克霍尔德氏菌BTF5对西瓜枯萎病的抑制率达63.09%，经过8代传代培养后抑制效果依然稳定。乔志伟等[11]从黄壤中分离出多株溶磷细菌，其中伯克氏菌属菌株W4的溶磷能力为 564.07 mg/L，显著高于其他菌株，具有良好的溶磷特性。陈凯等[12]通过温室防病增产效果试验发现越南伯克霍尔德氏工程菌株B418-37对黄瓜立枯病的防治效果达87.0%，菌株处理过的黄瓜幼苗生物量比空白对照增加19.7%；对小麦纹枯病的防治效果达 94.5%，生物量增加28.6%；这表明伯克氏菌株具有良好的生防效果。毛晓洁等[13]筛选出的伯克氏菌属菌株固氮酶活性达到（32.286±2.076） nmol/(h·mg)，ACC脱氨酶活性达到（5.393±0.362）μmol/(h·mg)，与无氮处理相比，越南伯克氏菌处理的白菜鲜重提高了46.59%，显示出了良好的促生潜能。目前，有关越南伯克霍尔德氏菌对烟草疫霉菌的防治作用尚未见报道，该研究获得的烟草疫霉菌拮抗菌株可为今后的烟草黑胫病生物防治提供优质生防资源。