L-谷氨酸-拌种灵耦合物的合成、生物活性及在烟草植株内的传导性

常 悦，李俊凯，陈顺顺，徐汉虹

（1.长江大学农学院，湖北 荆州 434025；2.华南农业大学植物保护学院，广州 510642）

内吸传导性农药在植物体内的传导方式直接影响农药的使用方法和防治效果［1，2］，是农药创制的研究热点［3-5］。改善农药的传导性，可影响农药在植物中的富集部位、持效时间、代谢过程和残留动态等毒理学行为［6］，对高效防治病害、减少农药用量、指导农药合理使用具有重要意义。已有研究表明，植物内源化合物与农药分子相偶联可以提高农药在植物体内的传导性［7-10］。在众多内源物质中，氨基酸在植物生命活动中发挥着重要作用，并可通过导管和筛管在植物的不同组织器官间传导。长江大学农学院农药课题组前期研究发现，申嗪霉素与氨基酸耦联可以改善申嗪霉素在蓖麻韧皮部的传导［11，12］；Xie等［13］研究发现，氨基酸转运蛋白参与了甘氨酸-氟虫腈复合物在蓖麻韧皮部的吸收与传导。所以将氨基酸与农药分子进行结合，在不改变其各自活性位点的前提下，有望得到能被氨基酸载体转运的新化合物分子。

拌种灵（Amicarthiazol）是一种广谱、高效的内吸性杀菌剂，属于噻唑类杀菌剂，可用于防治担子菌引起的禾谷类作物病害［14，15］。为了探究拌种灵的内吸传导量，改善拌种灵在植物体内的传导性，本研究在保留拌种灵噻唑基团与谷氨酸的氨基、羧酸结构的前提下，将拌种灵与谷氨酸进行耦联，合成了谷氨酸-拌种灵耦合物，并对其活性及传导性进行了初步研究。

目标化合物的合成路线如图1所示。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌种水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）由长江大学植物病理实验室提供。烟草品种为RG17，由云南红塔集团有限公司提供，于培养箱内催芽育苗，移栽入网室后自然生长至10～12叶期供试验使用。

1.2 主要试剂与仪器

L-谷氨酸由上海生化试剂公司生产；97%（质量分数，下同）拌种灵原粉由江苏南通江山农药化工股份公司提供；95%的氯代甲酸苄酯由江苏省新沂市汇力精细化工有限公司生产；40%溴化氢（HBr）的冰醋酸溶液由湖北省南漳县襄九精细化工有限责任公司提供；多聚甲醛、对甲苯磺酸、氯化亚砜等化学试剂为市售分析纯。

Bruker Avance DPX400型核磁共振仪，瑞士布鲁克公司；Agilent 1100 HPLC仪，美国安捷伦公司；LABOROTA 4001型旋转蒸发仪，德国博励行公司。WRR熔点测定仪，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 化合物的合成

1.3.1 N-苄氧羰基-α-氨基谷氨酸的合成（2） 将0.1 mol（14.7 g）L-谷氨酸溶于饱和NaHCO3溶液。冰浴条件下，缓慢滴加0.11 mo（l18.9 g）氯代甲酸苄酯，滴加完毕缓慢升至室温，反应24 h。反应结束，水相用30 mL乙醚洗涤，然后用6 mol/L的HCl酸化至pH为2，用乙酸乙酯（50 mL×3）萃取，无水MgSO4干燥，减压浓缩至干，得白色固体产物（2），重25 g，产率89%。

1.3.2 3-（3′-（苄氧羰基）-5′-氧代恶唑烷酮-4′-基）-丙氨酸的合成（3） 将0.04 mol（11.25 g）化合物（2）溶于200 mL甲苯，配备Dean-Stark分水蒸馏器和回流冷凝管，加入0.08 mol（2.4 g）多聚甲醛和0.002 4 mo（l0.46 g）对甲苯磺酸。体系回流反应约3 h。冷却，加入50 mL乙酸乙酯，分离有机相，用4 mL 0.3 mol/L K2CO3溶液洗涤，再水洗3次，无水MgSO4干燥，减压浓缩，得化合物（3），为黏稠状液体，产率81%。

1.3.3 3-（3-（苄氧羰基）-5-氧代恶唑烷酮-4-基）-丙氨酰氯的合成（4） 长颈烧瓶中加入0.01 mol（2.93 g）化合物（3）、0.05 mol（3.7 mL）氯化亚砜及2 mL四氯化碳，配置冷凝和干燥设备，回流反应至无气体放出，蒸去溶剂，加入干燥的二氯甲烷10 mL，蒸去溶剂，得化合物（4），直接进入下一步反应。

1.3.4 3-（3-（苄氧羰基）-5-氧代恶唑烷酮-4-基）-丙酰-（4′-甲基-5′-苯氨羰基）-噻唑-2-基-胺的合成（6） 将拌种灵原药（5）0.01 mo（l2.33 g）溶于25 mL干燥的四氢呋喃中，通入干燥氮气，加入1.1 mL三乙胺，冰浴中分次少量滴加0.01 mol化合物（4）。60℃回流反应3 h，冷却至室温，反应15 h，薄层色谱跟踪反应进程。反应结束，减压蒸发除去四氢呋喃，体系溶于50 mL二氯甲烷中，依次用15 mL水、15 mL HCl溶液（0.5 mol/L）、15 mL饱和NaHCO3溶液洗涤，再用水洗涤至中性。有机相用无水MgSO4干燥，蒸去溶剂，柱层析纯化（V石油醚∶V乙酸乙酯=5∶1）。得到白色固体产物（6），产率72%。

1.3.5 2-氨基-5-（4′-甲基-5′-（苯甲酰胺基）-噻唑-2-基-氨基）-5-羰基戊酸的合成（7） 化合物（6）中加入40%HBr的冰醋酸溶液10 mL，常温反应2 h，减压除去HBr和冰醋酸，加入甲醇溶解，减压浓缩至干，加入少量5%的醋酸溶解，然后用2%NaOH溶液调节pH至7左右，此时产生大量沉淀，过滤，用水洗涤滤饼（10 mL×3），干燥，甲醇重结晶，得白色固体（7），产率88%。

1.4 生物活性测定

采用菌丝生长速率法［16］测定L-谷氨酸-拌种灵耦合物对水稻纹枯病菌的抑菌活性。以拌种灵原药为对照，不加药剂为空白对照，每处理重复3次。制作含系列浓度药剂的PDA平板，取水稻纹枯病菌菌饼接种于平板中央，28℃条件下培养。采用十字交叉法测量菌落直径，按照下式计算各处理对菌丝生长的抑制率，根据浓度对数与抑制率几率值，利用DPS数据处理系统计算药剂对水稻纹枯病菌的毒力回归方程、相关系数以及有效抑制中浓度EC50。

菌丝增长直径（mm）=菌丝生长直径-菌饼直径；抑制率=（空白对照菌丝增长直径-药剂处理菌丝增长直径）×100%（/空白对照菌丝增长直径）

1.5 供试化合物对烟草植株处理方法

分别称取0.8 g L-谷氨酸-拌种灵耦合物与拌种灵原药，用少量0.5 mol/L的HCl溶解，加入3滴吐温-80，用水稀释至1 L，得到800 mg/L的药液，取少量稀释到200 mg/L的药液。采用涂叶和水培2种处理方法。涂叶方法：挑选长势一致的烟草，选择中部第6、第7片叶用毛笔涂布800 mg/L的药液，使药液均匀涂布叶片两面，处理后于12、24、36、48 h取样分析处理叶片、顶端生长点、茎和根中供试化合物的含量。水培方法：小心挖取整株烟草，洗净后置于200 mg/L的药液中，培养24 h取样。

1.6 烟草植株样品前处理方法

参照胡奎等［17］的方法，取药剂处理烟草植株叶片、顶端生长点（包括1～2片未完全展开的叶片）及药剂处理叶片附近的茎、植株根部。4部分样品各取鲜重10 g，洗净风干粉碎，加入100 mL甲醇超声波提取10 min，过滤，滤渣继续超声波提取2次，所得提取液浓缩至2 mL。先加入5 mL甲醇冲洗萃取柱，冲洗结束后，将提取液加入到饱和NaCl溶液20 mL中，移至固相萃取柱上，抽滤速度控制在3滴/s，完全转入后弃去水相，用80%（V/V）甲醇40 mL冲洗萃取柱。萃取液浓缩定容至5 mL，微孔滤膜过滤，待测。

1.7 色谱条件

色谱柱为ODSC18反相键合柱（5μm，250 mm×4 mm），柱温25℃，流动相为甲醇∶水=55∶45（V/V），流速1 mL/min，进样量20μL，检测波长270 nm。

1.8 标准溶液配制及标准曲线的绘制

准确称取供试化合物10.0 mg，用色谱甲醇溶解并定容至20 mL，得到500 mg/L标准品溶液，再稀释成浓度为50.000 00、25.000 00、12.500 00、6.250 00、3.125 00、1.562 50、0.781 25 mg/L的系列标准溶液，在“1.7”方法条件下测定各标准溶液的吸收峰面积，绘制标准曲线。

1.9 添加回收试验

分别称取烟草的叶片、茎和根各10 g，分别加入L-谷氨酸-拌种灵耦合物和拌种灵的标准溶液，添加水平分别为10、5、1μg/g，按照上述方法进行前处理和检测，平行测定3次，计算回收率与相对标准偏差。

2 结果与分析

2.1 合成化合物的结构表征

以谷氨酸与拌种灵为原料，合成了目标化合物L-谷氨酸-拌种灵耦合物，新化合物结构表征数据如下：2-氨基-5-（4′-甲基-5′-（苯甲酰胺基）-噻唑-2-基-氨基）-5-羰基戊酸，分子式为C16H18N4O4S（7），白色固体，m.p.＞260℃。1H-NMR（400 MHz，DCl，D2O）δ：1.89～2.11（m，2H，OOC-C-CH2），2.50（s，3H，CH3-thiazol），2.53～2.66（m，2H，OC-CH2-），3.34～3.39（m，1H，OOC-CH-C），7.05～7.66（m，5H，-C6H5），12.41（s，1H，-COOH）；13C-NMR（400 MHz，DCl，D2O）δ：17.2，21.5，22.4，25.0，26.2，30.5，31.4，51.3，119.0，120.5（2C），123.7，128.6（2C），138.9，151.3，157.2，160.7，170.5，170.7；ESI-MSm/z：725.2［2M+H］+，363［M+H］+，234.0［M-C5H8NO3］+。

2.2 目标化合物的抑菌活性

以水稻纹枯病菌为供试菌种，拌种灵为对照药剂，对L-谷氨酸-拌种灵耦合物进行室内毒力测定。结果表明，L-谷氨酸-拌种灵耦合物一定程度上保留了对水稻纹枯病菌抑制活性，EC50略低于对照药剂拌种灵。L-谷氨酸-拌种灵耦合物毒力回归方程为y=1.347 8x+4.058 9，R2=0.996 5，EC50为4.99 mg/L（13.76μmol/L）。拌种灵毒力回归方程为y=1.599 0x+4.259 2，R2=0.987 6，EC50为2.91 mg/L（12.47μmol/L）。

2.3 分析方法的线性范围

L-谷氨酸-拌种灵耦合物保留时间为11.89 min；拌种灵保留时间为7.20 min。在0.781 250～50.000 00 mg/L浓度范围内，L-谷氨酸-拌种灵耦合物及拌种灵的质量浓度与液相色谱峰面积之间存在较好的线性关系。L-谷氨酸-拌种灵耦合物的质量浓度与液相色谱峰面积之间的线性方程为y=7.220 8x-0.088 8，R2=0.999 5；拌种灵质量浓度与液相色谱峰面积之间的线性方程为y=132.240x-21.455，R2=0.999 9。从线性方程分析发现，谷氨酸-拌种灵耦合物的线性方程的斜率与拌种灵相比减小了很多，其原因是在色谱检测器上的响应值降低了，说明拌种灵的氨基上发生取代后，改变了拌种灵分子原来的共轭结构，使分子的紫外吸收明显减弱。

2.4 添加回收率结果

L-谷氨酸-拌种灵耦合物和拌种灵在烟草叶片、茎和根的添加回收率为86.50%～97.93%，相对标准偏差为1.26%～9.54%。各个样本的添加回收率和相对标准偏差符合残留分析的要求。

2.5 烟草植株中供试化合物含量的测定结果

拌种灵和L-谷氨酸-拌种灵耦合物处理后不同时间在烟草叶片、顶端生长点、茎和根中的含量如表1所示。从表1可以看出，拌种灵处理烟草叶片后，被处理的叶片中拌种灵的含量在48 h达到峰值，并且顶端生长点内拌种灵的含量也逐渐增加，茎中拌种灵的含量变化没有明显的规律，在根部没有检测到拌种灵的存在。与拌种灵相比，L-谷氨酸-拌种灵耦合物处理叶片后，处理的叶片中L-谷氨酸-拌种灵耦合物的含量在24 h达到最大值，且在12 h叶内含量就迅速达9.45μg/g，36 h又迅速下降至6.20 μg/g，随后48 h略有下降。与此相对应，在顶端生长点，24 h也达到吸收的最大值，达3.73μg/g，并且在处理初期，生长点L-谷氨酸-拌种灵耦合物的含量明显高于拌种灵处理的植株。在茎中，L-谷氨酸-拌种灵耦合物的含量在测定的整个阶段都在1.00μg/g左右，但在根部，L-谷氨酸-拌种灵耦合物的含量在36 h达到最大值，并且超过茎部的含量，比较可以发现顶端生长点和根中化合物含量大于茎，表明该化合物能通过植物叶片吸收，经韧皮部移动并向生长点积累。利用2种药剂进行水培处理烟草植株后，24 h取样分析，发现拌种灵在植株各部位的含量大小顺序为根＞叶片＞茎＞顶端生长点，而L-谷氨酸-拌种灵耦合物在植株各部位的含量大小顺序为根＞顶端生长点＞叶片＞茎，并且在顶端生长点中的含量达73.78μg/g。

表1 L-谷氨酸-拌种灵耦合物及拌种灵处理烟草苗后在植株各部位的含量

3 小结与讨论

本研究将农药分子与氨基酸进行耦联，构建了全新的L-谷氨酸-拌种灵耦合物。结果表明，L-谷氨酸-拌种灵耦合物的抑菌活性与拌种灵相接近。2种化合物都有内吸活性，在施药部位都可以被植物吸收。通过根部水培施药后24 h可在烟草顶端生长点检出2种化合物，表明化合物可被根吸收并且向上传导，同时耦合物的吸收传导性得到增强，相同处理时间下在烟草各部位检出含量均大于拌种灵，且顶端生长点的含量高于叶片和茎中的含量，说明拌种灵在谷氨酸的氨基酸官能团介导下，有很强的向植株生长点积累的倾向。于中部叶片施药时，拌种灵不能传导到根部。而在12 h根部即可检出L-谷氨酸-拌种灵耦合物，表明其具有很强的向下传导能力，是一个良好的双向传导化合物。

本试验成功改善了拌种灵的传导性，L-谷氨酸-拌种灵耦合物表现出比拌种灵更优越的内吸传导性，推测这一过程可能是借助植物体氨基酸转运载体来实现。同时研究中发现涂叶处理中L-谷氨酸-拌种灵耦合物在根部48 h测得含量较36 h有所降低，可能是该化合物在植物体内发生降解，分解为拌种灵。若氨基酸-杀菌剂耦合物能借助植物体内的氨基酸载体改善其向下传导性，而在到达植物根部时又能分解释放出杀菌剂分子，将极大改善植物根部病害难以防治、用药量大的现状。引入氨基酸改变农药在植物体内的传导方向，使农药在特定部位积累，这样就可能在减少农药用量的情况下通过提高农药的靶向性，降低使用成本，提高防治效果。同时，还可以通过增强靶向性减少农药对其他部位的传导积累，提高农药的安全性，减少对环境的污染，这将大大缓解农药残留问题，对农产品的安全生产具有重要意义。