响应面优化广西红蓝草红色素提取工艺及其特性研究

祁百巍，陈炼红

(西南民族大学 生命科学与技术学院，成都 610041)

当前食品添加剂中使用大量的食用红色素，可分为天然红色素和人工合成红色素两大类。合成色素具有色泽鲜艳、着色力强、坚牢度大、性质稳定、成本较低等优点[1]。但绝大多数合成色素对人体有害，安全性低。而天然色素主要是从动物、植物和微生物中提取的，对人体的安全性较高[2]。不仅如此，天然色素含有丰富的营养物质及对人体有益的功能性活性成分,具有抗菌消炎、抗氧化、降血脂等功能[3]。因此，食用天然色素的研究有着广阔的发展前景。

红蓝草，又名红丝线，属爵床科植物，是桂西染色植物之一，主要分布于我国云南、广东、广西、贵州等地[4]。红蓝草红色素含有黄酮、生物碱等成分，具有保护肝脏、降压、镇咳等功效[5]。现已应用于五彩糯米饭、红兰酒等广西特色食品中，可见红蓝草红色素是很好的天然食用色素来源。目前国内对红蓝草的研究多见于成分分析和药理活性研究，而对红蓝草红色素提取工艺优化和其稳定性与抗氧化活性的研究鲜有报道。

本试验基于传统的水浸提法，辅以超声、微波，筛选最佳提取方法并优化其工艺条件，以及色素在不同条件下的稳定性和抗氧化活性，为红蓝草红色素的生产及在食品行业中的进一步开发应用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红蓝草：购自广西来宾忻城县(去杆取叶，洗净，恒温干燥60 ℃，粉碎，备用)；无水乙醇、氯化钠、氯化钙、硫酸镁、氯化铝、氯化铜、氯化钾、抗坏血酸、山梨酸钾、磷酸氢钾、邻苯三酚、水杨酸、DPPH、过氧化氢、Tris-HCl、硫酸亚铁：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；D101大孔树脂：分析纯，成都市怡语化学试剂经营部。

DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；UV-6100紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；KQ5200DB数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；5804R离心机 德国Eppendorf公司；G8023EHL-V8微波炉 广东格兰仕集团有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程及操作要点

1.2.1.1 红蓝草红色素提取

红蓝草叶→清洗→烘干→粉碎→提取→离心→收集上清液→红蓝草红色素提取液→纯化→红蓝草红色素纯化液→旋转蒸发→红蓝草红色素浓缩液。

1.2.1.2 操作要点

将红蓝草叶洗净沥干，置于60 ℃鼓风干燥箱中干燥6 h，粉碎过80目筛密封，置于冰箱保鲜层备用。称取2 g的红蓝草粉末于锥形瓶中，按料液比1∶20 (g/mL)加入超纯水，摇匀，进行提取，将粗提液倒入50 mL试管中，经6000 r/min离心10 min后，吸取上清液，稀释20倍，测定在490 nm处的吸光值[6]。将上清液过D101大孔树脂柱，吸附12 h后，分别用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液洗脱，并将红黄色部分进行收集，于80 ℃下蒸发4～5 h得到红蓝草红色素浓缩液，密封置于冰箱中备用。

1.2.2 红蓝草红色素3种提取方法比较

水浴浸提法：称取3份红蓝草粉2 g，置于锥形瓶中并做好标记，料液比1∶20 (g/mL)加入超纯水，摇匀后将其置于50 ℃的恒温水浴锅中1 h。将粗提液离心，吸取上清液并将其稀释20倍后测定吸光度值。

准确称取3份红蓝草粉2 g，按料液比1∶20 (g/mL)加入超纯水，摇匀后将其分别置于恒温水浴锅、超声波清洗仪、微波炉中进行提取。超声波清洗仪功率设置为200 W，超声波清洗仪与恒温水浴锅温度均设置为50 ℃，超声时间与水浴时间均为1 h，微波功率设置为280 W，微波时间为80 s。提取结束，将粗提液离心，吸取上清液并将其稀释20倍后测定吸光度值。

1.2.3 红蓝草红色素提取的单因素试验

由1.2.2确定红蓝草红色素的提取方法，参照上述操作要点，准确称取1 g红蓝草粉末，以吸光值为评价指标，分别考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL)、不同温度(40，50，60，70，80 ℃)、不同超声时间(30，60，90，120 min)以及不同超声功率(60，120，180 W)对吸光值的影响。

1.2.4 红蓝草红色素提取的响应面优化试验

在单因素试验的基础上，以料液比(A)、超声温度(B)、超声时间(C)、超声功率(D)为自变量，以吸光值为响应值，采用L9(34)响应面分析法，优化红蓝草红色素提取工艺。试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平表Table 1 The factors and levels of response surface test

1.2.5 验证试验

根据响应面试验结果，得到最佳优化条件，进行3次平行试验，在波长为490 nm处测出吸光度，进行分析比较。

1.2.6 红蓝草红色素稳定性试验

准确量取2.5 mL色素提取液，用不同溶液定容到50 mL，以吸光值为评价指标，分别考察静置3 h后不同pH(2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)、不同温度(20，40，60，80，100 ℃)和分别静置1，2，3 h后不同食盐浓度(0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%)、不同蔗糖浓度(0.5%、1%、3%、5%、10%)、不同还原剂浓度(0.1%、0.5%、1%)、不同防腐剂浓度(0.1%、0.3%、0.5%)及不同金属离子(Mg2+、Ca2+、Al3+、Cu2+、K+)条件下对吸光值的影响。

1.2.7 红蓝草红色素的抗氧化活性试验

运用体外抗氧化活性研究，测定红蓝草红色素对·OH、O2-·及DPPH·的清除能力，并在一定条件下与抗坏血酸作对比来评价红蓝草红色素的抗氧化活性。

1.2.7.1 红蓝草红色素对·OH清除能力的测定

用超纯水将红蓝草红色素浓缩液稀释为10，20，30，40 mg/mL的色素溶液，并配制相同浓度的抗坏血酸溶液[7]，分别取9份1 mL 9 mmol/L FeSO4，1 mL 9 mmol/L水杨酸加入到试管中，摇匀，分别加入2 mL不同浓度的红蓝草红色素溶液及抗坏血酸溶液，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2，振荡摇匀后避光静置30 min，测定510 nm处吸光值，并使用蒸馏水取代色素溶液作空白组,以蒸馏水代替H2O2作对照组。

式中：A0为空白组的吸光度；Ax为实验组的吸光度；Ax0为对照组的吸光度。

1.2.7.2 红蓝草红色素对O2-·清除能力的测定

取9份4.5 mL Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)，放入试管中， 25 ℃预热20 min后分别加入1 mL不同浓度的色素溶液及抗坏血酸溶液，再加入0.4 mL 25 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25 ℃水浴反应5 min，立即测定420 nm处吸光值，用蒸馏水取代色素溶液作空白组。

式中：A0为空白组的吸光度；Ax为实验组的吸光度；Ax0为对照组的吸光度。

1.2.7.3 红蓝草红色素对DPPH·清除能力的测定

取2 mL不同浓度的色素溶液及抗坏血酸溶液，分别加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液(无水乙醇配制)，避光反应30 min，在517 nm处测定吸光度，并使用蒸馏水取代色素溶液作空白组,以无水乙醇代替DPPH·自由基作对照组。

式中：A0为空白组的吸光度；Ax为实验组的吸光度；Ax0为对照组的吸光度。

2 结果与分析

2.1 提取方法的确定

以490 nm波长下测得的吸光度值为指标，3种方法的提取效果见图1。

图1 不同提取方法对红蓝草红色素吸光度值的影响Fig.1 Effects of different extraction methods on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

由图1可知，3种提取方法对红蓝草红色素的提取效果：超声波辅助水提法>水浴浸提法>微波辅助水提法。超声波辅助水提法主要利用超声波的空化效应加速植物有效成分的溶出，另外，其次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎等也能加速目标物质的扩散释放，并充分与溶剂混合，提高提取效率。因此，在相同的温度下，单位时间内超声波辅助水提法比常规的水浴水提法的提取效果更佳。微波辅助水提法主要利用物质在微波场中吸收微波能力的差异使提取体系中某些区域或某些组分被选择性加热，从而使得目标物质从基体和体系中分离[8]。然而，运用微波辅助水提法提取红蓝草红色素的效果不佳，且比常规的水浴水提法要差，可能的原因是经微波处理产生的高温对色素物质造成破坏[9]。综合考虑，确定以超声波辅助水提法作为提取红蓝草红色素的最优方法，并运用响应面分析法确定此方法的最佳提取工艺参数。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 不同料液比对红蓝草红色素提取效果的影响

由图2可知，随着料液比的增加，色素提取液的吸光值呈先上升后下降的趋势，且在1∶20时达到峰值。随后，提取溶剂用量增加，色素提取量下降，但下降幅度不大，曲线趋于平稳，原因可能是随着料液比的增加，红蓝草与提取溶剂的接触面增加，色素类物质向溶剂溶出的阻力减小，使得提取液中溶解的色素含量增加；当料液比达到一定值时，色素中的有效成分基本溶出，传质推动力减小，提取量有所降低[10]。

图2 不同料液比对红蓝草红色素吸光度值的影响Fig.2 Effects of different solid-liquid ratios on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

2.2.2 不同超声温度对红蓝草红色素提取效果的影响

温度对植物成分的提取影响很大[11]。由图3可知，当超声温度低于50 ℃时，色素提取液的吸光度随温度增加而缓慢上升，并于50 ℃时达到顶峰，当超声温度超过50 ℃时，色素提取液的吸光度急剧下滑，说明温度过低不利于色素的溶出，适当提高温度可加速分子的运动从而促进色素溶进溶剂，但过高的温度易对色素或细胞组织造成破坏，从而使吸光度降低。因此，通过超声温度单因素试验可知，将超声温度设置为50 ℃，红蓝草红色素的提取效果最佳。

图3 不同超声温度对红蓝草红色素吸光度值的影响Fig.3 Effects of different ultrasonic temperatures on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

2.2.3 不同超声时间对红蓝草红色素提取效果的影响

由图4可知，随着超声时间的延长，色素含量上升，当超声时间为120 min时，色素提取液的吸光度达最高值，继续延长提取时间，色素含量下降明显。这是因为适当的超声波作用时间，可利用其空化作用增加色素与试剂的接触面积，提高色素溶解程度；过长的超声作用时间，可能会导致色素结构被破坏，不利于色素提取[12]。

图4 不同超声时间对红蓝草红色素吸光度值的影响Fig.4 Effects of different ultrasonic time on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

续 表

2.2.4 不同超声功率对红蓝草红色素提取效果的影响

由图5可知，在不同的超声功率下，色素提取液的吸光度随功率的加大先增加后减小，当超声功率在120 W时红蓝草红色素提取液的吸光度达到最大值。其原因可能是随着超声功率的提高，超声的空化作用增强，溶剂更易渗入细胞中，提高红蓝草红色素的溶出[13]。当超声功率大于120 W时，超声波空化作用的加强可能会破坏色素的结构，不利于色素提取。因此，通过超声功率单因素试验可知，最佳超声功率为120 W。

图5 超声功率对红蓝草红色素吸光度值的影响Fig.5 Effects of different ultrasonic power on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

2.3 响应面优化试验分析

2.3.1 响应面试验结果及方差分析

由Design-Expert软件分析上述4个因素后设计出29组试验方案，试验结果数据见表2，响应面模型的方差分析和显著性检验见表3。

表2 Box-Benhnken设计及试验结果Table 2 Box-Benhnken design and experimental results

表3 响应面模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted response surface model

由表3可知，根据试验数据建立的回归方程模型P<0.0001，模型差异极显著。失拟项P=0.5702>0.05，表明该模型对试验数据拟合充分。利用该模型可较好地描述各试验因素与响应值的真实关系，并且可以优化红蓝草红色素的最佳工艺条件。回归方程为：Y=-0.41+0.085A+0.045B+0.013C+6.442E-003D-0.015AB-0.015AC+0.025AD-0.068BC+0.024BD-0.014CD-0.011A2-0.12B2-0.041C2-0.036D2。

依据F值大小可以判断各试验因素对提取的影响程度，F值越大，表明该试验因素对提取效果的影响越显著。F(A)=72.84、F(B)=20.87、F(C)=1.85、F(D)=0.42，即各试验对红蓝草红色素含量影响大小为料液比>超声温度>超声时间>超声功率，并且料液比和超声温度对红蓝草红色素的影响达到了极显著水平。

2.3.2 交互作用的结果分析

采用响应面的坡度陡峭程度来衡量试验因素交互作用对响应值的影响强弱，响应曲面相对平缓，说明该因素交互作用对红蓝草红色素含量影响作用较小[14]。各试验因素交互作用对红蓝草红色素含量的影响见图6～图11。

图6 料液比和超声温度对吸光度值影响的响应面和等高线Fig.6 Response surface and contour plot for the effects of solid-liquid ratio and ultrasonic temperature on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

图7 料液比和超声时间对吸光度值影响的响应面和等高线Fig.7 Response surface and contour plot for the effects of solid-liquid ratio and ultrasonic time on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

图8 料液比和超声功率对吸光度值影响的响应面和等高线Fig.8 Response surface and contour plot for the effects of solid-liquid ratio and ultrasonic power on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

图9 超声温度和超声时间对吸光度值影响的响应面和等高线Fig.9 Response surface and contour plot for the effects of ultrasonic temperature and ultrasonic time on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

图10 超声温度和超声功率对吸光度值影响的响应面和等高线Fig.10 Response surface and contour plot for the effects of ultrasonic temperature and ultrasonic power on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

图11 超声时间和超声功率对吸光度值影响的响应面和等高线Fig.11 Response surface and contour plot for the effects of ultrasonic time and ultrasonic power on the absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer

从响应面图中可直观地看出各因素对响应值的影响，响应面图和表3的拟合二次多项式模型的方差分析表明， A，B对红蓝草红色素提取的影响极显著，二次项B2、C2的影响极显著，D2的影响显著，交互项BC的影响极显著。各因素交互作用对红蓝草红色素含量影响顺序为BC>AD>BD>AB>AC>CD。

2.3.3 最佳工艺平行验证试验

根据得到的模型预测红蓝草红色素的最佳提取工艺为料液比1∶25，超声温度53.05 ℃，超声时间108.54 min，超声功率157.10 W，在此提取条件下响应值最大，为0.421338。为便于实际操作，将工艺调整为：料液比1∶25，超声温度53 ℃，超声时间109 min，超声功率160 W。在上法条件下进行3组平行试验，吸光值分别为0.429，0.418，0.422，均与响应面预测最优结果0.421338相差很小，因此用响应面法对红蓝草红色素的超声波辅助水提工艺的优化效果良好。

2.4 稳定性试验结果

2.4.1 不同pH对红蓝草红色素稳定性的影响

由表4可知，在pH为2～9范围内，吸光度随pH的增大而降低。其中在pH为5～7时，色素相对稳定；在低酸性环境下，吸光度较高，说明红蓝草红色素在酸性环境中具有较好的耐受性；在碱性条件下，吸光度锐减，说明其耐碱性差。综合来看，红蓝草红色素能应用于酸性到中性食品的着色，尤其是果汁、糖果等，且具有良好的稳定性。

表4 不同pH环境下红蓝草红色素吸光度的变化Table 4 The changes in absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer under different pH values

2.4.2 不同温度对红蓝草红色素稳定性的影响

由表5可知，色素在20～100 ℃之间基本稳定，说明红蓝草红色素能在加热情况下稳定存在，具有较高的热稳定性，一般高温不易造成损失，适用于一般热加工食品。

表5 不同温度环境下红蓝草红色素吸光度的变化Table 5 The changes in absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer under different temperatures

2.4.3 食盐对红蓝草红色素稳定性的影响

由表6可知，红蓝草红色素在浓度为0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%食盐溶液中吸光度的变化不大，且延长静置时间，其吸光度变化幅度不大。因此，红蓝草红色素对食盐具有较高的耐受性。

表6 不同浓度的食盐溶液及静置时间下红蓝草红色素吸光度的变化Table 6 The changes in absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer under different salt concentration and standing time

2.4.4 蔗糖对红蓝草红色素稳定性的影响

由表7可知，随着蔗糖溶液浓度上升，吸光度值呈上升趋势。随着静置时间的延长，红蓝草红色素于0.5%、1%、10%的蔗糖溶液中吸光度值有所增加，这表明蔗糖对红蓝草红色素具有明显的增色作用，且色素具有高的耐糖性，适用于糖渍食品的生产加工。

表7 不同浓度的蔗糖溶液及静置时间下红蓝草红色素吸光度的变化Table 7 The changes in absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer under different sucrose concentration and standing time

2.4.5 还原剂对红蓝草红色素稳定性的影响

由表8可知，同一浓度，随着静置时间延长，吸光值变化不大。相同时间内，抗坏血酸浓度越高，色素吸光值越大。说明还原剂对红蓝草红色素具有良好的增色作用。

表8 不同浓度抗坏血酸溶液及静置时间下红蓝草红色素吸光度的变化Table 8 The changes in absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer under different ascorbic acid concentration and standing time

2.4.6 食品防腐剂对红蓝草红色素稳定性影响

由表9可知，随着山梨酸钾浓度的增加以及静置时间的延长，吸光值稳定在0.550左右，说明食品防腐剂对红蓝草红色素稳定性的干扰较小，适用于大部分主要以山梨酸钾作为食品防腐剂的包装食品。

表9 不同浓度山梨酸钾溶液及静置时间下红蓝草红色素吸光度的变化Table 9 The changes in absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer under different potassium sorbate concentration and standing time

2.4.7 金属离子对红蓝草红色素稳定性的影响

由表10可知，在Mg2+、Ca2+、K+溶液中，随着静置时间的延长，吸光值变化不明显，说明这3种金属离子对色素稳定性的影响较小；而在金属铝离子溶液中，吸光值明显高于其他种类金属离子溶液，且随着静置时间的延长，吸光值增加，说明其能保护红蓝草红色素，且存在增色作用；但在Cu2+溶液中吸光值比其他金属离子溶液低，且随着静置时间的延长，吸光值下降。结果表明，金属铜易使红蓝草红色素发生降解，在贮存或加工过程中应避免与铜器接触。

表10 不同金属离子及静置时间下红蓝草红色素吸光度的变化Table 10 The changes in absorbance values of red pigment from Eccoilopus cotulifer under different metal ions and standing time

2.5 抗氧化性试验结果

2.5.1 红蓝草红色素对O2-·清除能力

由图12可知，反应体系中，超氧阴离子随红蓝草红色素浓度的增加不减反增。经过分析与讨论，造成此现象的原因可能是：由于仅经过粗纯化，红蓝草色素提取物中可能含有与邻苯三酚结构相似的能够产生超氧阴离子的物质，但由于色素溶液中可清除O2-·物质的有效浓度较低，对O2-·的清除速度小于其产生速度，所以出现红蓝草红色素对O2-·的清除能力呈负增长的现象，而其他可能性有待深入探究。

图12 红蓝草红色素对O2-·的清除能力Fig.12 The scavenging ability of red pigment from Eccoilopus cotulifer on O2-·

2.5.2 红蓝草红色素对·OH清除能力

由图13可知，红蓝草红色素对·OH具有一定的清除效果，浓度越高，对·OH的清除率越大，且清除率的增长速度越迅速。但是从图中可看出，相同浓度的抗坏血酸对羟自由基的清除率高于红蓝草红色素，且在40 mg/mL时清除率已高达99.78%。结果表明，红蓝草红色素能高效去除羟自由基且浓度越高清除率越大，但效果低于同样浓度下的抗坏血酸。

图13 红蓝草红色素对·OH的清除能力Fig.13 The scavenging ability of red pigment from Eccoilopus cotulifer on ·OH

2.5.3 红蓝草红色素对DPPH·的清除能力

由图14可知，在浓度为10 mg/mL时，抗坏血酸对DPPH·的清除率已高达93.50%，之后随着浓度的增大，基本无变化。而红蓝草红色素对DPPH·的清除率随着浓度的增大而增加，并呈一定比例。结果表明，红蓝草红色素对DPPH·具有一定的清除能力，但其清除效果较相同浓度的抗坏血酸弱。

图14 红蓝草红色素对DPPH·的清除能力Fig.14 The scavenging ability of red pigment from Eccoilopus cotulifer on DPPH·

3 结论

通过方法筛选试验确定最佳提取方法是超声波辅助水提法，并在单因素试验基础上，运用响应面分析法展开四因素三水平试验，得到红蓝草红色素的最佳提取参数为：料液比1∶25 (g/mL)，超声温度53 ℃，超声时间109 min，超声功率160 W。

稳定性试验表明：红蓝草红色素有良好的耐热性、耐酸性，能够在食盐溶液和蔗糖溶液及含山梨酸钾的体系中稳定地存在，但在碱性环境中耐受性较差，红蓝草红色素对大部分金属离子具有稳定性，其中Al3+对其起增色作用，另外，其在还原剂存在的条件下，还原剂浓度的升高与放置时间的延长都能使稳定性有所加强。

体外抗氧化活性试验表明：红蓝草红色素能显著清除·OH、DPPH·，且与色素浓度呈正相关，存在一定的抗氧化活性。

优化的红蓝草红色素提取工艺合理、可行，这为将来更深入地研究红蓝草红色素的工业化生产提供了一定的理论支持。红蓝草红色素能更好地满足我国食品加工行业对食品天然色素的需求，开发出更好的功能性食品。