内质网应激相关mRNA GRP78、IRE1和Caspase12在HBV相关肝细胞癌组织中的表达及临床意义

梁善雄，邓伟,2，黄有全，于飞，杨育华，黄天壬,2

（1.广西医科大学附属肿瘤医院，广西 南宁 530021；2广西壮族自治区肿瘤防治研究所，广西 南宁 530021）

0 前言

肝癌是消化系统中最常见和最具侵袭性的恶性肿瘤之一，其最常见的组织学病理类型是肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）。广西作为中国肝癌高发地区之一情况不容乐观，2016年广西肝癌的发病率和死亡率分别为45.60/10万和39.26/10万，居各类恶性肿瘤之首[1]。HCC的发展经历肝损伤、炎症、硬化和癌变等多个过程，是一种以HBV慢性感染为主的多因素参与的疾病[2]。内质网（ER）是人体中最大的膜结构细胞器，与蛋白质的合成、折叠以及翻译后修饰等生理功能息息相关，当HBV感染、基因突变、Ca2 +失衡等不利因素导致的异常蛋白质过多堆积在ER影响其正常功能将会引起内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）[3]。

早期的ERS是细胞的自我保护反应，表现为可通过未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）应对各种应激，当应激持续存在并超过UPR的处理能力时将会导致细胞的损伤和凋亡。ERS诱导细胞凋亡是近年来研究癌症治疗的又一热点，已有学者研究发现，索拉菲尼作用于HepG2细胞激活了ERS，葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein,GRP78）表达升高进而激活肌醇需要酶1（Inositol-requiring Enzyme 1，IRE1）通路，细胞凋亡率增加[4]；但目前HCC的早期诊断和治疗都不尽如人意，治疗以手术切除方式为主，但HCC极易转移及复发，术后5年复发率超过70%以及复发后5年生存率为28.3%,预后差[5]，因此研究其发生发展的机制及寻找潜在的诊疗靶点对早诊早治具有重要的临床意义。本研究将收集HBV -HCC组织，检测并分析肝癌组织及癌旁组织中ERS特征性分子GRP78、IRE1和内质网凋亡因子半胱天冬氨酸蛋白酶12（Caspase12）mRNA相对表达水平，同时探讨这些mRNA与患者临床病理特征的关系，以期为阐明ERS在HCC的发生发展中的作用和对HCC患者的诊治提供有价值的参考信息。

1 材料和方法

1.1 一般资料

49例HCC患者癌组织及对应的癌旁组织（距手术切缘＞2cm）来自广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科2015年7月至2016年12月手术切除的标本，且均经病理学检查确诊为HCC，其中男性43例，女性6例，年龄27～69岁，平均年龄（48.6±10.3）岁；所有入选患者未合并其他恶性肿瘤、丙型肝炎、药物性和酒精性肝病等，术前未经任何的抗癌治疗，HBV-DNA定量大于1000IU/mL；本研究所用样本的采集经患者或监护人知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

（1）RNA提取根据Trizol试剂操作说明书抽提肝癌及癌旁组织的总RNA,用NanoDrop2000超微量样本分光光度计检测RNA浓度与纯度，以A260/A280nm的比值在1.8-2.1之间判定RNA纯度符合要求。

（2）RT-qPCR检测肝癌及癌旁组织中GRP78、IRE1及Caspase12 mRNA的表达按逆转录试剂盒PrimeSciptTMRTreagent kit说明书将提取的RNA合成cDNA；所用引物序列（表1）委托上海生物工程有限公司设计并合成。按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMII试剂盒说明书建立反应体系：2ulcDNA,0.8ul上游引物,0.8ul下游引物,10ulTB Green以及6.4ulRNAfree水；qPCR反应条件如下：95℃预变性5min，95℃变性 5s，60℃延伸 30s，40个循环；溶解曲线 95℃ 15s，60℃ 30s，95℃ 15s。以 β-actin 作为内参，2-△△Ct法计算目的基因的相对表达水平。

（3）研究对象临床资料的收集和整理按表2收集研究对象的人口学及临床病理相关信息，将肝癌组织中目的基因的相对表达量高于癌旁组织2倍的患者纳入高表达组，其余患者归入低表达组。

1.3 统计学方法

应用SPSS 24.0对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（mean±SD）的方式表示，采用配对t检验分析癌和癌旁2组间目的基因相对表达量均值的差异；内质网应激相关mRNA表达的高低与临床病理特征间的关联分析应用χ2检验或理论频数在1-5之间选用校正卡方值法；ERS相关mRNA相关性采用Pearson相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列

2 结果

2.1 GRP78、IRE1及Caspase12在HBV-HCC组织及癌旁组织中的表达

图1示，PCR结果显示，与配对的癌旁组织相比，肝癌 组 织 中 GRP78（t=4.321，P＜0.001）和 IRE1（t=6.558，P＜0.001） mRNA的表达水平明显升高，且差异具有统计学意义；Caspas12 mRNA在肝癌组织与癌旁组织中的表达差异无统计学意义（t=1.856,P＞0.05）。

图1 内质网应激相关基因GRP78、IRE1及Caspase12在相关性肝细胞癌及癌旁组织中的表达水平比较

2.2 GRP78、IRE1及Caspase12的表达水平与HBVHCC临床病理特征的关系

卡方检验分析结果显示，HCC患者中GRP78 mRNA的表达水平与肿瘤大小、肿瘤数目以及包膜是否完整有关联，P＜0.05；IRE1、Caspase12 mRNA 的 表 达 水 平 分 别 与 血 清谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）和谷丙转氨酶（alanine amino transferase, ALT）有关联，均P＜0.05；；与其他临床病理特征无相关性，P＞0.05，见表2。

2.3 HBV-HCC组 织 中GRP78、IRE1及Caspase12 mRNA表达的相关性分析

图2示，HCC组织中，GRP78与IRE1 的表达呈正相关，r=0.489,P＜0.01；而 GRP78和 Caspase12，IRE1和 Caspase12的表达均无相关性，r分别为0.268和0.210，均P＞0.05。

3 讨论

近年来，ERS在肝癌的发生发展以及治疗的研究中引起了人们的关注，其中有许多ERS相关基因参与到其中发挥重要作用，如 GRP78、IRE1、Caspase12等[6]。GRP78作为 ER的分子伴侣蛋白，是判断发生ERS最常用最经典的标志蛋白，正常生理状态下，GRP78位于ER膜上，与UPR通路蛋白IRE1结合而处于失活状态，一旦发生ERS,GRP78的表达上升，转而结合未折叠或错误折叠的蛋白帮助其正确折叠或促进其降解来维持ER的稳态；随着分子生物学的不断发展，GRP78或有望成为肿瘤治疗的靶点，GRP78主要位于癌细胞表面，参与许多肿瘤的发生发展，并与肿瘤治疗的耐药、复发、转移及预后相关[7-9]，有学者认为，GRP78的表达水平对判断HBV-HCC临床预后具有重要的价值[10]；本研究结果表明，GRP78 mRNA在HBV-HCC组织明显高于癌旁组织，提示在HCC的发生发展中伴随ERS,这与李亚萍和Masahiro Shuda等学者的研究结果基本一致[10,11]。

表2 肝细胞癌组织中GRP78、IRE1及Caspase12 mRNA表达与临床病理特征的关系

图2 HBV相关性HCC中GRP78和IRE1以及Caspase12 mRNA的相关性分析

IRE1是ER膜上具有蛋白激酶和核酸内切酶双重作用的Ⅰ型跨膜蛋白，当GRP78与IRE1解离后，IRE1发生寡聚化和自身磷酸化从而激活IRE1的核酸内切酶活性，将X-盒结合蛋白1（XBP1u）剪切为有活性的XBP1s,XBP1s通过上调ERS相关基因的表达来增强ER对蛋白质的折叠和降解能力从而缓解ERS[12]。研究发现，IRE1在结肠癌、肺癌及肝癌等肿瘤中表达均上调[13]，Ying Wu等学者用二乙基亚硝酸诱导的肝癌模型研究中显示，敲除IRE1能够抑制肝癌的发生[14]。本研究发现，IRE1mRNA在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织，提示UPR通路IRE1在HCC中被激活。当ERS持续存在且UPR不能与之抗衡时，激活的IRE1可通过肿瘤坏死因子受体2（TRAF2）募集凋亡信号调节激酶1（ASK1）形成IRE1-TRAF2-ASK1复合物以及与Pro-Caspase12相互作用，从而激活应激活化蛋白激酶（JNK）和Caspase12,随后启动下游相关凋亡信号诱导细胞凋亡[15, 16]。Caspase12存在于ER外膜上，是ERS诱导细胞凋亡的特异性起始因子，激活后的Caspase12能级联激活Caspase9和Caspase3诱导细胞凋亡[17]；有研究表明，敲除小鼠的Caspase12基因后，由ERS诱导的凋亡也受到抑制[18]。在我们的研究中，Caspase12在HCC组织与癌旁组织中的表达无显著差异，一方面可能是HCC组织中只激活适度的ERS,UPR尚能与之抗衡而没有启动Caspase12凋亡途径，因为ERS持续时间及严重程度决定应激细胞的结局[19]；还可能与GRP78能阻断Caspase12的激活而抑制其表达有关，这是机体发生ERS后过表达GRP78为缓解ERS对自我的保护，但具体的机制需进一步研究[20]。

本研究结果显示，ERS相关mRNA与肿瘤大小、数目、包膜完整、ALT以及AST有关，与其它临床病理特征无关联。提示ERS的激活参与HCC的发展，ERS的标志物GRP78可作为评估HCC进展的潜在指标。GRP78、IRE1和Caspase12两两比较结果显示：GRP78与IRE1表达呈正相关，提示ERS激活UPR。有学者通过建立不同程度内质网应激模型发现，IRE1表达水平随GRP78表达的上升而上升，说明ERS程度与UPR在一定程度上相关[21]，与本研究结果相似；未发现GRP78和Caspase12，IRE1和Caspase12存在相关关系，但有研究显示，抑制GRP78的表达后Caspase12的表达明显上调且能加速细胞凋亡[22]，提示GRP78可能是肿瘤治疗的潜在靶点。

综上所述，HCC组织中GRP78和IRE1mRNA的表达水平升高，提示激活了内质网应激并进一步激活了IRE1未折叠蛋白反应，内质网应激可能与HCC的发生发展有关，内质网应激调节剂GRP78抑制剂和Caspase12激活剂作为治疗HCC的潜在药物具有很大的应用前景，结合GRP78作为潜在诊断标志物，这或许为HCC的早诊断和早治疗开辟新途径，但本研究未见癌和癌旁组织中Caspase12存在明显差异，或许与研究样本量有限有关，因此在今后的研究中应扩大样本量并对患者进行随访，收集生存预后等信息做更全面更深入的研究。