基于PRiME HLB净化高效液相色谱串联质谱法测定饲料中苯乙醇胺A

摘要：建立高效液相色谱串联质谱法测定饲料中苯乙醇胺A的分析方法。样品用80%（V∶V）乙腈水溶液提取，经PRiME HLB净化后，采用高效液相色谱串联质谱法测定，外标法定量。以01%甲酸水溶液和甲醇作为流动相，用Hypersil GOLD C18色谱柱 （19 μm，21 mm×100 mm）进行梯度洗脱，采用电喷雾离子源（ESI+）、正离子扫描多反应监测（MRM）模式进行定性和定量分析。结果表明：苯乙醇胺A在50～2000 ng· mL-1的范围内线性关系良好（r=09992）。在100、200、500 μg· kg-1添加水平下的回收率为822%～915%，相对标准偏差（n=6）为68%～85%，检出限（以信噪比>3计）为01 μg·kg-1，定量限（以信噪比>10计）为03 μg·kg-1。该方法精密度好，灵敏度高，可用于大批量快速准确测定饲料中的苯乙醇胺A，有效提高工作效率。

关键词：PRiME HLB;高效液相色谱串联质谱法;苯乙醇胺A;饲料

中图分类号：O 658文献标志码：A文章编号：0253-2301（2021）02-0024-08

DOI： 1013651/jcnkifjnykj202102005

Determination of Phenylethanolamine A in Feed Based on High Performance Liquid

ChromatographyTandem Mass Spectrometry After Purified by PRiME HLB

CHEN Qihuang

（Xiamen Inspection and Test Center of Agricultural Products Quality and Safety， Xiamen， Fujian 361009， China）

Abstract： A analytical method for the determination of phenylethanolamine A in feed by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry was established. The samples were extracted with 80% （V∶V） acetonitrile aqueous solution. After purified by PRiME HLB， the samples were determined by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry and quantified by external standard method. Then， the gradient elution was performed through Hypersil GOLD C18 chromatographic column （1.9 μm ， 2.1 mm×100 mm） by using 0.1% formic acid aqueous solution and methanol as the mobile phase. And the qualitative and quantitative analysis was carried out by using the modes of electrospray ionization （ESI+） and positiveion scanning multiple reaction monitoring （MRM）. The results showed that phenylethanolamine A had a good linear relationship in the range of 5.0～200.0 ng·mL-1 （r=0.9992）. The recoveries were 82.2% to 91.5% at the supplemented levels of 10.0， 20.0 and 50.0 μg·kg-1， the relative standard deviations （n=6） were 6.8% to 8.5%， the limits of detection （the SNR being greater than 3） were 0.1 μg·kg-1， and the limits of quantification （the SNR being greater than 10） were 0.3 μg·kg-1. The method had good precision and high sensitivity， and could be used for the rapid and accurate determination of phenylethanolamine A in large quantities， which would effectively improve the work efficiency.

Key words： PRiME HLB; High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（HPLCMS/MS）; Phenylethanolamine A; Feed

苯乙醇胺A，又稱克伦巴胺，英文名称Phenylethanolamine A，CAS：1346746-81-3，分子式C19H24N2O4，分子量34417。据报道，苯乙醇胺A被非法添加到饲料中以促进动物生长，减少脂肪沉积，提高瘦肉率，但其会在动物组织中残留，食用含有苯乙醇胺A残留的动物源性产品，对人体健康具有潜在危害＼[1＼]。为加强饲料及养殖环节质量安全监管，保障饲料及畜产品质量安全，我国农业部于2010年12月27日发布中华人民共和国农业部第1519号公告，禁止在饲料和动物饮水中使用苯乙醇胺A等物质。因此，加强对苯乙醇胺A的残留检测具有非常重要意义。

目前，苯乙醇胺A的检测方法主要有胶体金快速检测法（CGIA）＼[2＼]、酶联免疫吸附测定法（ELISA）＼[3-4＼]、高效液相色谱法（HPLC）＼[1，5-6＼]和高效液相色谱串联质谱法（HPLCMS/MS）＼[7-12＼]。HPLCMS/MS能准确定量确证，方法检出限低、灵敏度高，前处理大多采用固相萃取净化技术，但固相萃取小柱需要活化平衡等步骤， 过程耗时长，消耗溶剂量大，前处理比较复杂烦琐，又有流速控制要求，操作不当易造成损失，降低回收率。Oasis PRiME HLB 具有特殊设计的筛板、填料以及生产工艺，对于分析富含蛋白质、脂肪、磷脂、糖类的动物源性食品，经Oasis PRiME HLB 净化后能去除内源性磷脂等非极性干扰物＼[13＼]，被应用到兽药残留及违禁添加物检测等领域＼[14-19＼]。目前，采用PRiME HLB 净化方法测定饲料中苯乙醇胺A未见研究报道。本研究采用PRiME HLB 净化测定饲料中苯乙醇胺A，旨在为控制饲料中苯乙醇胺A的非法添加提供可靠检测手段，满足饲料中苯乙醇胺A的快速测定要求。

1材料与方法

11试验仪器

陈其煌：基于PRiME HLB净化高效液相色谱串联质谱法测定饲料中苯乙醇胺A2021年第2期2021年第2期陈其煌：基于PRiME HLB净化高效液相色谱串联质谱法测定饲料中苯乙醇胺ASHIMADZU 30A（CBM30A＼CTO30A＼LC30AD＼SIL30AC＼DGU20A5R，日本Shimadzu公司）;Triple Quad 5500三重四极杆质谱仪（美国AB Sciex公司）;KQ500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;MilliQ去离子水发生器（美国MILLIPORE公司）;CF16RXⅡ高速冷冻离心机（日本HITACHI公司）; PL602S电子天平[梅特勒托利多（上海）有限公司];VORTEX GENIUS 3 旋涡混合器（德国IKA公司）;VXⅢ多管涡旋振荡器[安简（北京）科技有限公司];Vacuum Manifold Processing Station 固相萃取儀（美国Agilent公司）。

12试验试剂

苯乙醇胺A标准品（Phenylethanolamine A）（上海安谱实验科技股份有限公司）;所用甲醇、乙腈为色谱纯试剂（美国TEDIA公司）;甲酸为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）;Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（3 cc 60 mg，美国Waters公司）;Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（6 cc 200 mg，美国Waters公司）;Oasis MCX固相萃取小柱（3 cc 60 mg，美国Waters公司）;实验室用水为MilliQ高纯水;有机相针式滤器（尼龙，13 mm，022 μm，上海安谱实验科技股份有限公司）。

13试验方法

131样品前处理（1）样品制备。按照GB/T 146991-2005进行采样＼[20＼]，按GB/T 20195-2006《动物饲料试样的制备》＼[21＼]要求对样品进行制样处理，饲料样品粉碎后过1 mm 孔径的分析筛，混匀后装入密闭封口塑料袋中，避光冷藏保存。（2）样品处理。准确称取2 g（精确到001 g）饲料样品于50 mL离心管内，加入80%乙腈水溶液80 mL，涡旋振荡混匀，于超声波清洗器中超声提取10 min后，再涡旋混匀振荡1 min后，于9000 r·min-1高速离心10 min，取上清液2 mL直接加载到PRiME HLB 固相萃取小柱， 无需活化平衡直接过柱，收集流出液，取适量流出液过022 μm尼龙有机相滤膜，供高效液相色谱串联质谱仪测定。同步做空白提取液和空白添加试样。

132标准系列溶液的配制准确称取苯乙醇胺A标准品10 mg至100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即含苯乙醇胺A 100 μg·mL-1标准储备液，于-18℃避光保存备用，有效期6个月。量取储备液用甲醇稀释到1 μg·mL-1，作为苯乙醇胺A标准中间液，于-18℃避光保存备用，有效期3个月。精密量取适量的苯乙醇胺A标准中间液用同类基质空白样品提取液配制，制得50、100、200、500、1000、2000 ng·mL-1系列对照溶液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

133提取溶剂和提取方法选择取阴性饲料样品添加苯乙醇胺A标准溶液后，分别采用乙腈、80%乙腈水溶液、01%甲酸80%乙腈水溶液、02%甲酸80%乙腈水溶液、01%甲酸60%乙腈水溶液作为提取溶剂，其余步骤均按131（2）样品处理进行，考察比较5种提取溶剂的回收率情况。取阴性饲料样品添加苯乙醇胺A标准溶液后，在加入80%乙腈水溶液后，分别同步进行涡旋振荡和超声2种方法提取，其余步骤均按131（2）样品处理进行，考察比较2种提取方法的回收率情况。

134固相萃取柱选择分别选择PRiME HLB和MCX两种固相萃取柱进行比对试验，选用PRiME HLB柱时按131（2）样品处理进行;选用MCX柱时提取按131（2）样品处理进行，其余步骤如下：MCX柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化平衡后，准确取40 mL提取液过柱，再依次用3 mL水、3 mL 2%的甲酸水溶液、3 mL甲醇淋洗，弃淋洗液，抽干MCX小柱，再用5 mL4%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，在50℃水浴氮吹仪吹至近干。准确加入10 mL的01%甲酸20%乙腈水溶液溶解残余物，过膜上机测定。

135基质效应考察取阴性饲料样品按131（2）样品处理进行，得到的空白样品提取液配制基质标准曲线与溶剂标准曲线进行上机分析，考察比较苯乙醇胺A的响应强度。

14色谱与质谱条件

141色谱条件色谱柱：Hypersil GOLD C18 （19 μm，21 mm×100 mm）;流动相：A相为01%甲酸水溶液，B相为甲醇;流速：030 mL·min-1;洗脱程序：0 ～05 min维持10% B，05～4 min线性变化至95% B，4～7 min维持95% B，7 min～71 min线性变化至10% B，并维持到10 min。柱温30℃。进样量：10 μL。

142质谱条件电喷雾离子源（ESI+），正离子扫描模式，扫描方式为多反应监测（MRM）;电喷雾电压（IS）4500 V，辅助气温度（TEM）550 ℃，雾化气（GS1）压力50 psi，辅助气（GS2）压力50 psi，气帘气（CUR）压力35 psi。

15定性与定量分析在相同试验条件下，试样溶液的色谱峰保留时间与标准品的色谱峰保留时间偏差在±25%之内，并且试样溶液谱图中定性离子的相对丰度与同等条件下得到的标准溶液谱图相比，定性离子对同时出现，且定性离子对的相对丰度允许偏差符合欧盟2002/657/EC中的规定，则可判定样品中存在对应的被测物＼[22＼]。基質标准工作溶液注入仪器检测，获得质量浓度与响应值（色谱峰面积）线性相关的标准工作曲线，外标法定量。

2结果与分析

21质谱条件优化

在ESI+中，用质量浓度10 μg·mL-1的苯乙醇胺A标准溶液以针泵50 μL·min-1连续注入质谱仪进行全扫描，获得＼[M+H＼]+的准分子离子峰3450，以其作为母离子进行轰击，获得碎片离子。图1为苯乙醇胺A一级、二级全扫描质谱图。选择信号较强的两个碎片离子和母离子组成两对监测离子对。在MRM模式下，进一步优化去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）、射入电压（EP）和碰撞池出口电压（CXP）等参数。经优化获得的MRM离子对及质谱条件见表1。注：A为一级质谱图，B为二级质谱图。

22色谱条件优化

色谱条件优化试验以乙腈和甲醇2种有机试剂作为洗脱流动相考察苯乙醇胺A的分离度和灵敏度。结果表明2 种有机试剂都可达到分离度要求，从经济因素方面考虑，选择甲醇作为有机相洗脱流动相。在水相中加入01%甲酸调节pH值后，苯乙醇胺A的响应值比水相未加甲酸的响应值高。甲醇浓度太低，不能有效地调整峰形，浓度太高又抑制了电离，降低了灵敏度。以甲醇和01%甲酸水溶液为流动相，通过梯度洗脱方式，缩短分析时间，得到理想的峰形和灵敏度。图2为50 ng·mL-1苯乙醇胺A标准溶液的MRM色谱图。

23提取溶剂和提取方法的确立

分别采用乙腈、80%乙腈水溶液、01%甲酸80%乙腈水溶液、02%甲酸80%乙腈水溶液、01%甲酸60%乙腈水溶液作为提取溶剂进行添标回收试验，试验结果表明用80%乙腈水溶液、01%甲酸80%乙腈水溶液、02%甲酸80%乙腈水溶液提取苯乙醇胺A的添标回收率差别不大，均比用乙腈、01%甲酸60%乙腈水溶液提取的回收率好，综合考虑选择80%乙腈水溶液作为提取溶剂。提取方式选择比较了涡旋振荡和超声2种提取方式，结果表明这2种提取方式有良好的回收率。考虑操作简便、时耗等因素，确定选用涡旋振荡提取方式。

24固相萃取柱的选择

进行PRiME HLB和MCX两种固相萃取柱的加标回收率和净化效果对比试验，结果表明，两种固相萃取柱净化后的样品色谱图杂峰不多，均有较好的净化效果，净化后的样品加标回收率均在80%～90%。但用MCX固相萃取柱净化的样品加标回收率受前处理操作影响较大，在上样和洗脱环节中，要特别注意控制流速在1 mL·s-1以下，流速过大会降低回收率;同时，用MCX固相萃取柱净化，操作步骤多、耗时长、消耗溶剂多。综合考虑选择PRiME HLB固相萃取柱作为前处理净化萃取柱。

25基质效应考察结果取阴性饲料样品按上述前处理方法制备空白样品提取液配制基质标准曲线与溶剂标准曲线进行比较分析，结果显示，苯乙醇胺A在饲料基质中有一定的基质增强效应，基质效应随着进样量的加大而增强。为降低基质效应，提高定量准确性，本方法采取基质匹配标准曲线定量分析。

26方法学考察

261方法的线性范围采用建立的方法获得的标准曲线线性良好，在50～2000 ng·mL-1的质量浓度范围内，苯乙醇胺A质量浓度X与其峰面积Y的标准曲线线性方程为Y=637×104X-989×103，线性相关系数r为09992，标准曲线见图3。

262方法的灵敏度以空白样品低水平加标测试方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），以3倍信噪比（S/N>3）对应的浓度为方法检出限，以10倍信噪比（S/N>10）对应的浓度为方法的定量限。通过计算，该方法的检出限为01 μg·kg-1，定量限为03 μg·kg-1，参照《农业部1486号公告-1-2010饲料中苯乙醇胺A的测定 液相色谱串联质谱法》中苯乙醇胺A的方法最低检出限为002 mg·kg-1，方法最低定量限005 mg·kg-1＼[23＼]，本方法的灵敏度能够满足检测要求。

263方法的精密度和准确度分别添加适量的标准溶液至空白饲料样品中，制得100、200、500 μg·kg-1添加水平的样品各6个，按照建立的方法处理样品并进行HPLCMS/MS分离分析，图4～5为空白饲料样品和加标水平为500 μg·kg-1的饲料样品MRM色谱图。经测定计算，苯乙醇胺A的回收率为822%～915%，相对标准偏差为68%～85%，结果见表2，表明本方法具有良好的准确度，能满足兽药残留的分析要求。

27实际样品检测

将本方法用于15份饲料样品中的苯乙醇胺A残留量的测定，根据化合物的保留时间和质谱的离子相对丰度比来鉴别样品，所测定的样品均未检出苯乙醇胺A的残留。样品谱图本底干净没有干扰峰，化合物的保留时间稳定，质控样品添加苯乙醇胺A标准溶液平均回收率为873%，符合国家标准《GB/T 27417-2017 合格评定 化学分析方法确认和验证指南》的相关规定＼[24＼]。

3结论与讨论

本试验结果表明，不同的上样量均有良好的净化效果和回收率，如测试样品的浓度较低可增加上样量将净化液进行浓缩后上机测定。但1 mL上样量净化流出的液体量较少，过滤膜后样品量少，需要采用全回收样品瓶才能上机测定。05、10、20、50、100 μL等5种不同进样量的质谱响应值有良好的线性关系，保留时间稳定，峰形对称尖锐。进样量200 μL的色谱峰出现不对称前展峰，这是由于样品溶剂为纯有机相，通过转换溶剂降低有机相比例可以改善峰形。在测试样品浓度过高或过低时可通过改变进样量直接测定，以获得适宜的响应值从而准确定量。

本研究建立了高效液相色谱串联质谱法测定饲料中苯乙醇胺A的方法，样品用乙腈超声提取后经PRiME HLB固相萃取柱净化，以基质配制标准溶液外标法定量。样品前处理简单，消耗有机溶剂较少，线性范围宽，方法的定量限低，精密度和准确度高，符合方法学要求。该方法适合于批量实际样品的快速检测，能够满足药物残留分析要求，可用于饲料中苯乙醇胺A的批量筛查确证。由于条件等限制，本试验未将同具有促进生长调节作用的β受体激动剂类药物同时进行研究试验，有待下一步进行深入考察探究，以適合于样品多项目同时测定的需要，进一步提高工作效率。

参考文献：

[1]樊宇飞，苏晓鸥，刘萌超高效液相色谱测定猪配合饲料中苯乙醇胺A的研究[J]中国畜牧兽医，2013，40（5）：225-228

[2]聂雯莹，罗晓琴，李金超，等动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法的建立[J]中国农业科学，2015，48（9）：3931-3940

[3]张露露动物性食品中苯乙醇胺A免疫检测方法研究[D]北京：中国计量学院，2014

[4]项自来，王玲，夏苏干，等苯乙醇胺A单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立[J]中国畜牧兽医，2019，46（3）：849-857

[5]许秀琴，吴银良，杨挺，等超高效液相色谱法快速测定饲料中苯乙醇胺A的研究[J]宁波农业科技，2013（3）：2-4

[6] 王瑞国，苏晓鸥，王培龙，等超高效液相色谱法测定饲料中苯乙醇胺A[J]分析化学，2013，41（3）：389-393

[7]孙武勇，赵冰琳，张守杰，等超高效液相色谱串联质谱法测定饲料中苯乙醇胺A的残留量[J]色谱，2012，30（10）：1008-1011

[8]顾亮，丁磊液相色谱串联质谱法测定饲料中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A[J]化学分析计量，2012，21（1）：37-39

[9]刘谦，颜红液相色谱串联质谱测定动物肠衣中残留苯乙醇胺A[J]中国兽医杂志，2012，48（8）：73-75

[10]董文婷，朱曦，梁利妹，等液相色谱串联质谱法测定猪尿中苯乙醇胺A[J]湖北畜牧兽医，2013，34（6）：9-10，28

[11] 卢艳芬超高效液相色谱串联质谱法测定猪肉和猪尿中的苯乙醇胺A[J]检验检疫学刊，2013，23（1）：41-44，10

[12]徐素彬，赵立军，柏林，等高效液相色谱串联质谱法对家畜尿液中苯乙醇胺A残留检测研究[J]分析化学，2013，41（5）：776-780

[13]刘新辉，王情情，张瑗，等Oasis PRiME HLB净化法测定动物源性食品中的兽药多残留[J]农产品质量与安全，2019（5）：15-20

[14]王智，施宗伟，郗存显，等PRiME HLB固相萃取/超高效液相色谱串联质谱法快速检测牛肝中18种促生长剂类药物残留[J]分析测试学报，2017，36（10）：1219-1223

[15]莫楠，张立佳，吕志勇，等PRIME HLB固相萃取/超高效液相色谱串联质谱法测定乳制品中头孢菌素类药物残留[J]乳业科学与技术，2018，41（4）：29-32

[16]蒋定之，辛丽娜，谭喜梅，等PRiME HLB固相萃取高效液相色谱串联质谱法同时快速测定鸡蛋中48种兽药残留[J]食品工业科技，2019，40（22）：259-266

[17]谭美龄，张钦，付鹏PRiME HLBUPLCMS/MS 法测定鲜蛋中6种药物残留[J]检验检疫学刊，2020，30（2）：13-16，27

[18]唐志理，侯思羽，邢东海，等PRiME HLB超高效液相色谱串联质谱法测定鸡蛋中硝基咪唑类药物残留量[J]食品安全质量检测学报，2020，11（18）：6716-6723

[19]刘新辉，孙艳丽，丁文慧，等Oasis PRiME HLB净化法测定动物源性食品中的硝基呋喃代谢物[J]农产品质量与安全，2020，（1）：32-36

[20]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会GB/T 146991-2005/ISO 6497：2002 饲料 采样[S]北京：中国标准出版社，2005

[21]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会GB/T 20195-2006/ISO 6498：1998 动物饲料 试样的制备[S]北京：中国标准出版社，2006

[22]王维国，李重九，李玉兰，等有机质谱应用在环境、农业和法庭科学中的应用[M]北京：化学工业出版社，2006：141

[23]中华人民共和国农业部农业部1486号公告-1-2010 饲料中苯乙醇胺A的测定 液相色谱串联质谱法[S]北京： 中国标准出版社，2010

[24]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会GB/T 27417-2017 合格评定 化学分析方法确认和验证指南[S]北京：中国标准出版社，2017

（责任编辑：林玲娜）

2021年第2期陈其煌基于PRiME HLB净化高效液相色谱串联质谱法测定饲料中苯乙醇胺A＼[J＼]福建农业科技，2021，51（2）：24-31.

收稿日期：2021-01-19

作者简介：陈其煌，男，1970年生，高级农艺师，主要从事农产品质量与安全研究。