缺氧胃癌癌细胞衍生的外泌体转移miR-143-5p促进胃癌侵袭、转移

刘 伟，胡永波，白少华，穆 磊，李 珊

1.长江大学附属仙桃市第一人民医院胃肠外科，湖北 仙桃 433000； 2.华中科技大学同济医学院附属同济医院胃肠外科； 3.长江大学附属仙桃市第一人民医院内分泌科

胃癌是我国最常见的癌症之一，也是与癌症相关的死亡的主要原因[1]。尽管临床中标准的外科手术切除、化学疗法、生物靶向治疗等联合辅助治疗广泛应用，但不良预后和持续较高的死亡率仍然存在，其中很重要的原因是胃癌的早期转移、侵袭性和对现有化疗药物耐药等综合因素所致[2]。因此，深入了解胃癌转移的分子机制以及发现新的治疗靶点至关重要。

肿瘤微环境在肿瘤免疫抑制、转移、化疗耐药发生中起关键作用，缺氧和炎症细胞浸润是与肿瘤微环境密切相关的两个主要因素[3-4]。氧气压力<5 mmHg的缺氧环境可在早期阶段促进癌细胞发生化疗药物抵抗、放疗抵抗和恶性进展[4]。缺氧诱导的胃癌细胞转移与调控癌细胞的上皮-间充质转化(EMT)相关，上皮表型的癌细胞转化为具有更强侵袭和转移力的间叶样癌细胞[5]。

在肿瘤微环境的研究中，除了癌细胞分泌诸如细胞因子、趋化因子和生长因子的可溶性介体外，细胞间信息传递的介体还包括癌细胞外泌体。高侵袭性癌细胞外泌体可以携带蛋白质、脂质和大量的非编码RNA，其中以microRNA(miRNA)最多[6]。外泌体传递的miRNA可以调控受体细胞的靶基因，介导一系列病理生理变化，如促进癌细胞侵袭、化疗耐药发生、肿瘤旁血管内皮细胞增殖，以及通过重塑肿瘤微环境来支持癌细胞的生长[7]。例如，头颈部鳞状细胞癌细胞释放的外泌体传递miR-21增强了微环境中肿瘤相关巨噬细胞的M2样极化，促进了微环境的恶性化改变[8]。缺氧环境下胰腺癌细胞释放的外泌体miR-103a通过诱导M2巨噬细胞增强肿瘤新生血管生成和血管通透性增加，最终导致肿瘤转移[9]。相同的miRNAs可能在不同肿瘤中发挥截然相反的作用，本研究探讨的miR-143-5p在前列腺癌、食管鳞癌中低表达，过表达miR-143-5p后肿瘤细胞出现明显的增殖抑制和迁移受限[10]。而部分研究发现在胃癌[11]、骨肉瘤[12]中miR-143-5p的异常高表达参与缺氧诱导的肿瘤恶性进展。miR-143-5p在不同肿瘤中截然相反的调控为我们的研究提供了思路，本研究中，我们探讨了缺氧诱导胃癌细胞外泌体释放及外泌体介导的miR-143-5p癌细胞间传递调控及促癌机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂：Trizol试剂(Thermo Fisher，美国)；BeyoFastTMSYBR Green One-Step qRT-PCR试剂盒(D7268M，碧云天生物技术公司)；胎牛血清、DMEM培养基(Gibco，澳洲)；兔多克隆抗体CD81(Cell Signaling，美国)，TSG101(Proteintech，美国)，CD9(Abcam,美国)，SMDT1(Invitrogen，美国)、GAPDH(Santa Cruz，美国)。兔多克隆抗体SMDT1(Abcam，美国)；山羊抗兔IgG(H+L)抗体、ECL发光液(碧云天生物技术公司)；Matrigel基质胶(Corning，美国)；磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制剂，LY294002(440202，Calbiochem，英国)最终药物浓度为1 μmol/L[13]，GW4869通过美国MedChemExpress(HY-19363)购买，最终使用浓度为10 mol/L[14]。miR-143-5p angomir和antagomir合成于武汉巴菲特生物技术公司。

1.1.2 仪器：细胞计数器(Nexcelom Bioscience LLC，美国)；紫外分光光度计(NanoDrop，美国)；电子显微镜、倒置荧光显微镜(OLYMPUS，日本，型号IX81)。

1.1.3 细胞培养及缺氧处理：人胃癌细胞系HGC、AGS细胞购自中国科学院上海细胞库。在DMEM培养基中培养，其含质量浓度为100 g/L的胎牛血清(Gibco,美国)。常氧条件为：37 ℃下在含体积分数为5%的CO2、20%的O2的常氧细胞培养箱中培养；缺氧条件为：37 ℃下在含体积分数为1%的O2的缺氧细胞培养箱中培养。

1.2 实验方法

1.2.1 外泌体分离和鉴定、PKH67荧光标记：胃癌细胞AGS、HGC增殖为约50%接种密度后更换10%无外泌体血清(16141-061，Gibco，美国)的DMEM培养基，并分别置于体积分数为1% O2的缺氧培养箱、常氧培养箱中继续培养48 h。将细胞培养液以2 000g(r=12.25 cm,常温)离心15 min和10 000g(r=8.19 cm, 4 ℃)离心30 min，以去除细胞碎片，然后以100 000g(r=7.18 cm,4 ℃)超速离心(日立超速离心机CP100NX)持续90 min。将沉淀的外泌体重悬于PBS中，储存于-80 ℃。分离外泌体并将其加载到碳涂层电子显微镜格栅，进行观察记录。纯化的外泌体用PKH67标记绿色荧光细胞接头试剂盒(MINI67-1KT，Sigma-Aldrich，美国)，根据制造商的说明进行操作，PKH67标记的外泌体被重悬并添加到常氧下胃癌AGS、HGC细胞。在37 ℃下孵育2 h后，通过荧光显微镜观察PHK67外泌体转染情况。

1.2.2 RNA提取和实时定量PCR(RT-PCR)：根据Trizol RNA(Thermo Fisher，美国)提取试剂说明提取总RNA，并检测RNA浓度。对于miR-143-5p，使用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR211，TIANGEN)生成cDNA。U6作为内参对照，所有结果利用2-ΔΔCt方法进行统计基因表达水平。

1.2.3 细胞克隆形成实验：AGS、HGC细胞制成单细胞悬液，将细胞悬液按照1×103/孔的浓度接种至6孔培养板。给予转染miR-143-5p antagomir/angomir、缺氧等干预处理，更换培养基并观察，待发现有肉眼可见的白色小点状细胞集落，显微镜下计数细胞集落，PBS清洗3次后经无水乙醇固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min后在倒置显微镜下计算细胞集落，每组设立3个复孔，共重复3次。

1.2.4 细胞转染：待培养板中AGS、HGC细胞生长为30%～50%时，更换只含10% FBS的DMEM培养基，按照转染试剂盒指示使用Lipofectamine 2000将miR-143-5p angomir/antagomir(50 nmol/L)、Control miRNA(50 nmol/L)(Thermo Fisher，美国)、野生型及突变型pcDNA 3.1 SMDT1(武汉巴菲特生物技术公司合成)转染至细胞，48 h后更换含10% FBS、双抗的培养基，细胞生长密度为80%时收集细胞，并通过RT-PCR、免疫印迹法进行验证。

1.2.5 荧光素酶报告实验：采用TOPglow/FOPglow TCF报告试剂盒(17-366，UPSTATE，美国)，70%贴壁生长的HGC细胞在转染Control miRNA、miR-143-5p、野生型pcDNA3.1 SMDT1质粒后继续培养48 h，再对转染miR-143-5p angomir的细胞中转入突变型pcDNA3.1 SMDT1。依据实验说明手册采用0.2 g/孔浓度转染TOPglow、FOPglow报告质粒，设置复孔，经细胞裂解液收集细胞，用荧光素检测仪分析Firely Lcuiferase荧光值(TOP)和Renilla Luciferase荧光值(FOP)，计算TOP/FOP的比值。

1.2.6 免疫印迹：使用RIPA缓冲液裂解细胞，包括蛋白酶抑制剂混合物(P1005，碧云天生物科技公司)。通过SDS-PAGE凝胶分离蛋白质，然后转移到PVDF膜上，用质量浓度为50 g/L的脱脂牛奶封闭后，膜在4 ℃与一抗反应过夜：CD81(1∶2 000)，TSG101(1∶1 000)，CD9(1∶1 000)，抗SMDT1(1∶1 000)、抗GAPDH(1∶5 000)。HRP偶联的二抗在室温下将膜孵育2 h温度。洗涤膜并在室温下孵育1 h HRP偶联的二抗。蛋白质是使用Bio-Rad ChemiDoc XRS+系统检测采集。

1.2.7 细胞划痕愈合实验：经过处理后的细胞接种至24孔培养板中，待细胞生长密度为80%～90%时，移液器200 ml枪头尖端横穿细胞表面形成划痕伤口。PBS溶液洗3次去掉悬浮的细胞，并在37 ℃常氧、缺氧培养箱中孵育48 h，伤口处的细胞迁移48 h后对前面进行拍照。所有实验重复3次。伤口面积使用Image J软件进行测量分析。

2 结果

2.1 胃癌细胞分泌外泌体的提取、鉴定胃癌细胞AGS、HGC通过无外泌体培养基在常氧、缺氧(体积分数为1%的O2)条件下培养48 h，分离并提取细胞培养液中的外泌体。胃癌细胞分泌的外泌体呈圆形颗粒范围为30～150 nm，无论缺氧、常氧条件下，HGC、AGS细胞的外泌体中均富含外泌体标记蛋白CD81、TSG101和CD9(见图1A～1B)，该结果证明我们有效地分离了外泌体。PKH67荧光试剂标记的外泌体与HGC细胞在共培养系统中孵育2 h后被内吞摄取(见图1C)。

注：A：电子显微镜分析外泌体的形态和大小；B：HGC、AGS细胞外泌体中标记蛋白CD81、TSG101和CD9蛋白的表达；C：免疫荧光显示HGC细胞内吞PKH67标记的外泌体(绿色)(放大200倍)。

2.2 缺氧胃癌细胞外泌体促进常氧细胞的侵袭、增殖为了明确缺氧条件下胃癌细胞来源的外泌体对常氧胃癌细胞的影响，我们通过外泌体与胃癌细胞的共培养，分析癌细胞迁移、侵袭和细胞克隆形成。缺氧条件下AGS、HGC细胞外泌体与常氧细胞相比，外泌体共培养中显著促进AGS、HGC细胞克隆形成、细胞增殖(P<0.01，见图2A)。在划痕愈合实验中，缺氧AGS、HGC细胞的外泌体比常氧AGS、HGC细胞外泌体具有更强的促癌细胞划痕愈合、运动能力(P<0.01，见图2B)。GW4869可有效阻断细胞外泌体释放。缺氧AGS、HGC细胞衍生的外泌体在添加GW4869后，细胞克隆形成活力明显受抑制，划痕实验中细胞迁移、侵袭能力下降显著(P<0.01，见图2C～2D)。结果表明缺氧诱导下胃癌细胞分泌外泌体能够高效地促进常氧细胞增殖、迁移和侵袭。

注：分离胃癌HGC、AGS细胞在缺氧、常氧条件下的外泌体，再将外泌体与HGC、AGS细胞进行常氧共培养。A：克隆形成实验分析外泌体对常氧AGS、HGC细胞的增殖影响；B： 细胞划痕后48 h，分析外泌体对常氧AGS、HGC细胞的增殖、运动影响；C～D： 缺氧胃癌细胞外泌体在添加GW4869后，转染HGC、AGS细胞，显示了细胞克隆形成、划痕愈合(48 h)的变化。放大200倍；**P<0.01。

2.3 缺氧诱导胃癌细胞的外泌体富集miR-143-5pmiRNA被包裹在肿瘤细胞的外泌体，并通过外泌体转移至新的癌细胞，最终在促进肿瘤细胞的增殖、化疗耐药及侵袭转移中起关键作用[11]。证据表明miR-143-5p在肺癌[15]、胆囊癌[10]和胰腺癌[16]的恶性进展中担当癌基因角色，胃癌中我们也证实了miR-143-5p的异常高表达。首先，我们通过在线肿瘤研究数据库Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)发掘了miR-143-5p在胃癌组织中表达水平明显高于癌旁组织，而且以对数秩采用Kaplan-Meier分析发现miR-143-5p的高表达与胃癌患者的整体不良预后有显著相关性(见图3A～3B，P<0.01)。miR-143-5p是否参与缺氧条件下胃癌细胞侵袭、增殖的调控？

进一步通过RT-PCR分析，我们发现在缺氧状态下AGS、HGC细胞外泌体与常氧胃癌细胞外泌体比较，miR-143-5p水平显著升高(P<0.01，见图3C)。缺氧诱导的miR-143-5p能否通过外泌体转移至其他胃癌细胞？我们将缺氧AGS、HGC外泌体分别与AGS、HGC细胞在常氧下共培养，受体细胞中miR-143-5p表达也显著增加，并且添加GW4869后能够有效抑制受体胃癌细胞AGS、HGC中miR-143-5p的过表达(P<0.01，见图3D)，这表明缺氧诱导的高水平miR-143-5p是大量通过外泌体转移至受体癌细胞。此外，为排除受体细胞自身miRNA合成的影响，我们加入RNA聚合酶Ⅱ的处理，该抑制剂不影响缺氧胃癌细胞来源外泌体对受体AGS、HGC细胞内miR-143-5p的增加，表明外泌体介导的miRNA转移引起受体细胞miR-143-5p的增加，而不是内源性miR-143-5p反应(P<0.01，见图3E)。正如我们观察到的，受体细胞中miR-143-5p上调基本是依赖缺氧胃癌细胞分泌的外泌体转移表达。

注：A：通过在线Starbase数据库，分析胃癌组织与癌旁正常胃组织中miR-143-5p的表达水平；B：Starbase数据库中在线分析miR-143-5p与胃癌患者预后关系；C：RT-PCR分析缺氧干预下胃癌细胞HGC、AGS分泌的外泌体中miR-143-5p表达差异；D：分离缺氧诱导后HGC、AGS细胞培养基中外泌体，外泌体分别转染常氧HGC、AGS细胞，并给予GW4869阻断外泌体释放，通过RT-PCR评估转染后常氧HGC、AGS细胞的miR-143-5p水平变化；E：RNA聚合酶Ⅱ抑制剂不影响受体HGC细胞中外泌体促miR-143-5p的增加。SD：误差线。NS：差异无统计学意义；**P<0.01。

2.4 缺氧条件胃癌细胞分泌的外泌体转移miR-143-5p促进常氧胃癌细胞的侵袭、增殖上述我们探讨了缺氧诱导胃癌细胞外泌体中miR-143-5p的高表达及细胞间转移，后续在外泌体与HGC细胞共培养中我们使用miR-143-5p antagomir模拟物转染。缺氧诱导的胃癌细胞HGC中过表达的miR-143-5p被miR-143-5p antagomir所抑制，图4A展示了不同干预条件下HGC细胞外泌体中miR-143-5p水平，miR-143-5p antagomir转染显著抑制了缺氧诱导的HGC细胞外泌体的miR-143-5p过表达(P<0.01)。

HGC细胞给予缺氧刺激、miR-143-5p antagomir转染干预，并分离其外泌体后将其与HGC细胞在常氧下进行共培养，通过细胞克隆增殖实验观察发现，相比较缺氧诱导的HGC细胞外泌体共培养高效促进HGC细胞的克隆增殖，miR-143-5p antagomir转染后再缺氧刺激来源的外泌体并不能有效促进HGC细胞在常氧下的增殖增加(P<0.01，见图4A)。同样的，在划痕愈合实验中，我们同样观察到缺氧诱导的HGC细胞外泌体明显增加常氧下HGC细胞的划痕愈合速度，miR-143-5p antagomir转染能够有效阻断缺氧诱导的HGC细胞外泌体对划痕愈合的影响(见图4B)。上述结果说明，缺氧诱导胃癌细胞的miR-143-5p的高表达，通过外泌体转移并促进其他癌细胞的增殖、侵袭。

注：A：miR-143-5p antagomir抑制常氧、缺氧胃癌HGC细胞中外泌体miR-143-5p表达；B～C:收集经miR-143-5p antagomir转染、缺氧处理后细胞培养液上清中外泌体，并将外泌体转染至常氧HGC、AGS细胞；miR-143-5p antagomir转染后外泌体能够抑制受体HGC、AGS细胞克隆形成(B)、细胞划痕愈合(C)。SD：误差线；**P<0.01。

2.5 缺氧诱导外泌体转移miR-143-5p下调SMDT1促进常氧胃癌细胞恶性进展为更进一步探索外泌体miR-143-5p过表达促进胃癌细胞恶性进展的分子机制，我们在线预测了miR-143-5p下游靶基因。通过三个独立的数据库(TargetScan、miRanda和miRDB)的分析，发现SMDT1基因是miR-143-5p的靶基因，并预测了其结合位点(见图5A)。通过双荧光素酶报告基因实验的分析表明，缺氧诱导HGC细胞分泌的外泌体和miR-143-5p angomir转染均能够抑制野生型SMDT1 3′-UTR报告基因的萤光素酶活性，而对突变型SMDT1 3′-UTR报告基因的萤光素酶活性无影响(P<0.01，见图5B～5C)。而且，免疫印迹实验证实miR-143-5p angomir能够显著抑制SMDT1蛋白的表达，而miR-143-5p antagomir转染HGC、AGS细胞后再给予缺氧诱导，其外泌体转移对常氧HGC、AGS细胞SMDT1蛋白的表达无影响(见图5D)。上述结果表明缺氧诱导miR-143-5p上调，外泌体介导miR-143-5p转移抑制SMDT1基因的转录、表达。

SMDT1在肿瘤的调控中主要通过PI3K/Akt途径，我们推测缺氧的外泌体介导的miR-143-5p可能通过PI3K/Akt信号通路促进肿瘤进展。常氧胃癌HGC细胞的PI3K/Akt的磷酸化通过免疫印迹分析，缺氧诱导的外泌体共培养能够明显上调PI3K、Akt的磷酸化，而HGC细胞转染miR-143-5p antagomir抑制miR-143-5p水平及下调的PI3K、Akt磷酸化(见图5G)。这些结果表明，缺氧诱导的外泌体miR-143-5p高表达通过激活PI3K/Akt磷酸化促进胃癌进展。加入PI3K抑制剂LY294002，阻断PI3K/Akt通路，最终阻断miR-143-5p angomir模拟物、缺氧诱导的胃癌细胞AGS、HGC的细胞克隆增殖和划痕愈合(见图5E～5F，P<0.01)。

注：A：SMDT1 3′ UTR与miR-143-5p预测结合的示意图，突变发生在预测的miR-143-5p结合位点；B～C：缺氧和miR-143-5p angomir作用下SMDT1 3′-UTR荧光素酶报告基因分析；D：miR-143-5p angomir和缺氧干预后的HGC细胞，其外泌体转移抑制常氧HGC细胞中SMDT1蛋白的表达；miR-143-5p antagomir能够逆转缺氧诱导的外泌体对常氧细胞SMDT1蛋白表达的抑制作用；E～F：HGC细胞转染miR-143-5p angomir或antagomir，再给予缺氧或常氧处理，最后提取的外泌体与常氧HGC细胞共培养。细胞克隆形成(E)及划痕愈合实验(F)发现PI3K抑制剂(LY294002)可阻断缺氧诱导的AGS、HGC细胞外泌体或miR-143-5p angomir转染对常氧AGS、HGC细胞增殖、侵袭的促进作用；G：免疫印迹分析，miR-143-5p antagomir转染能够抑制缺氧HGC细胞外泌体对常氧HGCLAMP3信号轴异常激活促进了食管癌的上皮细胞上皮-间叶样转化、化疗耐药的发生；miR-143-5p在外周血中的高表达可作为结直肠癌可靠的临床诊断标志物[12，23-24]。本研究中，我们也发现胃癌细胞在缺氧条件下通过miR-143-5p/SMDT1、PI3K/Akt信号通路来调控胃癌细胞的恶性进展，而且胃癌组织中miR-143-5p呈现明显高表达。细胞PI3K和AKT的磷酸化的激活作用；SD：误差线；**P<0.01。

3 讨论

缺氧是肿瘤微环境的特征之一，已经被证实是多种实体肿瘤恶性进展和化疗药物耐药发生的主要驱动力[17]。外泌体参与胃癌多种恶性进展的调控，但外泌体是否参与缺氧调控肿瘤进展的机制尚未得到很好的阐明。有研究强调了缺氧在促进肿瘤细胞外泌体分泌方面的重要作用[18]。缺氧诱导肿瘤细胞分泌的外泌体可能通过调节肿瘤内皮细胞衍生新生血管生成[19]，减少肿瘤细胞间粘附而促进癌细胞的侵袭、转移[17]。

我们发现缺氧胃癌细胞的外泌体促进常氧胃癌细胞的增殖和侵袭。有研究也发现，缺氧诱导鳞状细胞癌细胞分泌的外泌体被常氧细胞同化，并引起受体细胞发生EMT表型转化[20]。与以前的研究相似，肿瘤微环境的重要组成部分包括外泌体，该外泌体具有在细胞-细胞之间交换信号的作用，并且缺氧区域的肿瘤细胞可以将外泌体递送至正常氧区域的周围肿瘤细胞，从而这些受体细胞表现出更强的恶性侵袭、增殖。目前有种假说，认为外泌体的血浆水平可能作为独立的肿瘤生物标志物[21]，这也是本次研究欠缺的方面，总之，针对肿瘤微环境和肿瘤缺氧的治疗是未来抗癌策略一种可行的方法。

较少研究来阐明通过缺氧诱导的外泌体转运非编码RNA分子的功能和潜在调控机制。值得注意的是，缺氧微环境可能会影响源自肿瘤细胞的外泌体中miRNA的表达，而外泌体miRNA在调节肿瘤进展中起关键作用。例如，来自结肠癌细胞的外泌体miR-25-3p通过诱导转移前微环境的形成来促进结肠癌进展，并且可以用作临床预测肿瘤转移诊断的生物标志物[22]。已知多种癌组织中观察到异常的miR-143表达，提示miR-143具有广泛的促癌作用。miR-143-5p与HUG1基因的异常调控参与骨肉瘤细胞的恶性进展；miR-143-5p/

综上所述，本研究发现缺氧促进胃癌细胞外泌体释放，并且高表达外泌体miR-143-5p。这些富含miR-143-5p的外泌体被正常氧环境胃癌细胞内吞，抑制SMDT1后介导PI3K/Akt途径促进了癌细胞的增殖、侵袭、转移。这提示靶向外泌体或miR-143-5p可能是对抗胃癌的潜在治疗方向。