关于微生物检测技术及其在食品安全中的应用研究

◎ 张思怡，聂晓臻，俞方璐

（中检科（上海）测试技术有限公司，上海 201206）

近年来，在世界各国及各地区发生的微生物性食物中毒事件报告起数以及人数逐年增多，促使食品安全问题成为现代化发展中的重要社会问题。

因此为降低微生物性食品中毒事件，应当进一步强化安全意识，注重运用先进检测技术控制食品质量，最大限度的防范微生物污染食品，保证人们的身心健康，促进食品市场稳定运行。

1 微生物检测技术在食品安全检测中的重要性

微生物检测是食品安全保障中的重要环节，同时也是判断食品是否具备食用价值的根本性指标依据。目前主要检测对象包括蛋制品、奶制品、罐头、淀粉制品以及食品调味品等。其大多是人们生活中经常食用或使用的食品及配料，一旦其存在微生物污染，则会对人体健康产生较大的不利影响[1]。因此在相关食品检测中科学运用微生物检测技术是至关重要的，其有助于检验食品微生物类型与数量，筛查出不符合质量安全标准的食品，对食品行业的健康、持续发展具有积极意义。

2 食品安全检测中微生物检测技术的操作步骤

2.1 样本采集

采集罐头食品样本时，应使用无菌器械开展无菌操作。根据不同生产厂家、商标、品种、来源以及生产日期等进行分类。如按照生产班次进行检测样本采集，则需保障每个班次各品种的采样基数需大于3罐。如按照杀菌锅采样，则每锅可采集1罐，且每批每个品种应不少于3罐。当对成批罐头实施微生物检测时，发现有变形、膨胀、罐壁裂缝、破损等情况，可结合实际确定抽样数量。为保障微生物检测的有效性，需在采样后3 h内进行检验。

2.2 样本送检

送检食品微生物检测样本时，应当合理保存样本的完整性，不得在送检过程中出现变质、破碎等。送往实验室后由相关送检人员规范填写单据，并交由专业检测人员开展实验检验活动。

2.3 样本处理及检验

当样本送到实验室后，需对罐头样本进行一定的处理，从而便于开展检验检测。即是针对新鲜的固体及液体罐头样本进行捣碎、均匀后开展检验。如对样本实施冷冻，需及时进行解冻再采用对应的检测技术。具体步骤则是取2管肉汤或溴甲酚紫葡萄糖肉汤、2管肝片肉汤或者刚经煮沸并迅速冷却的疱肉培养基等。开展接种检样，通常情况下控制接种量在液体样本的1～2 mL、固体样本则在1～2 g即可。如固体与液体样本同时存在，可各取一半。在实施接种后放置于37 ℃环境中，并进行需氧菌培养检查以及厌氧菌培养检查。在将检样涂片以及革兰氏染色后实施镜检[2]。

2.4 结果报告

完成微生物检验后，如果所有需氧和厌氧培养基管内未发现细菌生长，则判断无菌试验合格，无需开展病原菌检测，表明罐头食品安全通过微生物检测，无污染现象。如果需氧培养基存在有细菌生长现象，并在涂片中观察到细菌，应针对检样开展进一步的致病性球菌检验和肠道致病菌检验。如果厌氧培养基中发现有细菌生长，涂片也存在细菌，则需对检验进行肉毒梭菌检验、魏氏梭菌检验等，准确判断样本的微生物污染类型。当检测结果出来后，由专门人员负责整理结果信息，规范填写检测报告，经审核后盖章，移交到分析评定人员，以此完成对罐头食品的微生物检测，准确评估食用价值。

3 微生物检测技术在食品安全中的具体应用

3.1 食源性病原菌免疫学快速检测技术及其应用

3.1.1 FAT技术

FAT技术是指荧光抗体检测技术，其原理是依据抗原抗体反应，通过利用荧光素对抗原或者抗体进行标记，然后在与待测样本中含有的抗原抗体相结合，借助荧光显微镜进行观察判断。该技术在实施过程中可分为直接法和间接法，直接法是指在待测样本中直接添加已知的荧光素标记的抗血清，通过洗涤后可在荧光显微镜下进行观察。间接法即是在待测样品中加入已知细菌的特异抗体，与待测样品进行反应和洗涤，加入荧光标记的第二和第三抗体，能够比较准确地获取微生物检测结果。该技术的优势则是简单快捷，但样品优势会受到非特异性荧光的干扰，导致结果准确性受到影响[3]。

3.1.2 EIA技术

EIA技术是指免疫酶技术，其是利用酶标记抗原抗体，以此检测相应抗原抗体的免疫技术。在当前食品安全检测中，常用酶联免疫吸附技术，其是将抗原抗体吸附在固相载体上，通过加入酶标记的抗体和抗原后，再加入酶的底物，从而在固相载体上实现反应。这一过程能够生成有色产物，其产量与加入的抗原存在密切关系。因此根据产物的颜色深浅等可开展定量测定，在实践中具有检测速度快、特异性较强、准确性高等优势。

3.1.3 具体应用

比如针对鲜牛奶、原料奶以及虾仁、熟食制品等进行微生物检测时，先科学处理被检抗原，可应用食源性病原菌免疫学快速检测技术。直接取选择性增菌液SC或者M肉汤1 mL，经过离心收集沉淀后，开展洗涤、悬浮、沸水浴20 min后，放置在4 ℃环境中保存备用。在检测过程中，将处理的抗原取50 µL，加入酶标板孔内。调节温度到50～60 ℃进行烘干，再使用冷甲醇固定5～10 min，洗涤后添加适当浓度的酶标单抗混合液，每孔控制50 µL/孔，并在37 ℃水浴孵育2 h。对每块备件样本板设置阳性、阴性和空白对照孔，有助于判断沙门氏菌。

3.2 食源性病原菌分子生物学快速检测技术及其应用

3.2.1 基因探针技术

微生物检测中的基因探针技术是一种利用同位素、生物素以及地高辛等开展检测标记的方法，基于标记一小段已知序列的寡聚核苷酸，在分子杂交与目的基因相结合，根据杂交信号寻找目的基因。按照探针标记方式可分为同位素和非同位素两种方法。其中同位素标记探针具有较强的特异性，对病原微生物的检测速度较快。不过该方式具有一定的放射性污染，而且核酸探针的半衰期相对较短，在检测工作中需要做好安全防护。非同位素则能够有效解决同位素检测存在的不足，且对人体无危害，不受紫外线照射影响等，应用效果较好[4]。

3.2.2 PCR技术

PCR技术是指多聚酶链反应技术，其是指利用体外酶合成特异DNA片段，并经历高温变性、低温退火、适温延伸等周期，促使DNA迅速扩增。同时该技术能够将目的基因或DNA片段在短时间内扩增到百万倍，并可利用肉眼直接观察，极大地缩短了检测时间。在实践运用中具有较强的特异性、灵敏度高、操作简单等特点。

3.2.3 生物芯片技术

生物芯片技术是指按照预定位置固定在固相载体上小面积内的千万个核酸分子所组成的位点阵列。在操作中相关人员需要先标记核酸片段，促使样品中的互补核酸片段能够与固相载体上的核酸分子进行杂交。通过利用芯片阅读仪，能够比较准确的检测出相应的杂交信号。该技术在本质上是一种高度集成化的反向斑点杂交技术，相比于传统检测技术而言，具有自动化程度高、操作简单、检测目标分子数量多、结果客观性强等问题。不过目前在食品微生物检测中该技术尚未实现全面推广，其是因为芯片制作技术难度大、开展样品制备以及标记等较为复杂[5]。但在未来发展中仍有较好的应用前景。

3.2.4 具体应用

在实际应用过程中，利用核酸探针能快速检测李斯特菌、大肠杆菌以及志贺菌等。其可从染色体序列以及质粒中直接分离出检测沙门氏菌的探针，但目前受限于技术以及检测环境等因素，大多只能在实验室中开展检测。而多聚酶链反应技术在食品安全中对微生物的检测应用，可有效检验食品中存在的沙门氏菌、肉毒梭状芽孢杆菌、单核细胞增多性李斯特杆菌等。该方法对大肠埃希氏菌的检测无需富集培养，即能够比较快速、准确地获得检测结果。生物芯片技术在具体应用过程中，能够一次性检测出多种潜在致病菌。而且检测时间相对较短，在几小时内即可完成全部操作步骤。比如通过引物扩增与芯片上的探针杂交，能够直接检测出食品样品中的致病菌，仅需6 h获得检测结果[6]。

3.3 食源性致病菌生物传感器检测技术及其应用

对于食品安全中应用微生物检测技术，可采用生物传感器技术，其是食源性致病菌检测中的重要组成部分。利用含有固定化生物物质与合适的换能器进行紧密结合，形成一种分析工具或系统。其中固定化生物物质主要包括酶、抗体、细胞、细胞器或复合体等，能够将生化信号顺利转化为电信号，同时促使其数量化。该技术在实践应用过程中，主要是利用致病微生物在呼吸时所产生的电子生物传感器，根据产生的电流大小判断微生物的浓度，进而检测出微生物致病菌的含量。该技术主要应用在食品中大肠杆菌、李斯特菌以及沙门氏菌的检测，可在几分钟内完成检测活动，检出限达到0.1～1.0 ng·mL-1，对于细菌毒素、真菌毒素等检测具有较好的检测效果。

4 结语

综上所述，针对不同品种的食品选择适当的微生物检测技术，如食源性病原菌免疫快速检测技术、分子生物学快速检测技术以及致病菌生物传感器检测技术等，侧重多种技术的结合，形成高效的组合检测形式，进一步加快食品微生物检测效率、保证检测结果具有客观性、可靠性，推动食品安全向前发展，维护社会和谐稳定。