人工代谢路径适配性的研究进展

郭亮，高聪，张丽，陈修来，刘立明

（1 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2 江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；3 盐城工学院海洋与生物工程学院，江苏盐城224051）

依靠微生物为基础的生物炼制可以绿色、高效合成工业化学品，而且还可以通过原料和微生物的改造，实现产品升级[1-3]。整合代谢工程、系统生物学、合成生物学与进化工程的系统代谢工程对微生物细胞进行定向设计、改造乃至重构，获得的微生物细胞工厂以生物质为原料，可高效合成能源化学品、营养化学品、医药化学品及材料等多种化学品，有效解决了化学炼制对环境的危害以及动植物提取对自然资源的依赖[3-9]。由人工代谢路径效率决定的微生物细胞工厂生产性能，显著影响工业化学品生产的经济适用性。然而，由于微生物细胞历经数百万年，进化出精密的调控机制，剪接代谢路径引起的代谢流扰动，不仅降低了人工代谢路径之间的适配性，而且降低了人工代谢路径与底盘微生物细胞之间的适配性，影响人工代谢路径效率[10]。一方面，由于酶的催化特性不同，引入的人工代谢路径酶，常常导致人工代谢路径代谢通量低与代谢通量不平衡[11]。因此，强化或平衡人工代谢路径的代谢通量，为提高目标化学品代谢路径的适配性，实现目标化学品的产量、生产强度和得率最大化提供了可能。另一方面，由于底盘微生物为合成目标化学品提供反应场所、底物和辅因子等，合成目标化学品不仅增加了人工代谢路径与细胞内源代谢路径之间的交互作用，而且还重编程了底盘微生物细胞的代谢流，增加了底盘微生物的代谢负荷[12,13]。因此，解除人工代谢路径与底盘微生物内源代谢路径之间的交互作用，强化人工代谢路径与底盘微生物细胞整体代谢网络的适配性，为提高人工代谢路径与底盘微生物之间的适配性提供了希望。

提高人工代谢路径之间，以及人工代谢路径与底盘微生物之间的适配性是解决上述问题的重要手段。适配性是构建高效微生物细胞工厂的关键，受到越来越多研究者的关注，成为了系统代谢工程研究的热点之一。本文围绕如何提高人工代谢路径的适配性，以及提高人工代谢路径与底盘细胞的适配性这一目标，系统综述了近年来最新研究成果，并分析了不同代谢调控策略的优缺点。随着系统代谢工程的发展，人工代谢路径之间以及人工代谢路径与底盘微生物之间的适配程度也将逐渐加深，为提高微生物细胞工厂的生产性能提供了希望。

1 提高人工代谢路径的适配性

基于天然或人工的代谢合成路径，设计与组装目标化学品合成路径是构建微生物细胞工厂的基础。然而，由于路径酶的催化性能不同以及目标化学品合成路径过长，导致化学品合成路径效率低，代谢通量不平衡，积累中间代谢产物，降低人工代谢路径的适配性。根据目标化学品代谢合成路径，发展了强化与平衡人工代谢路径的代谢通量的新策略，提高人工代谢路径的适配性。

1.1 强化人工代谢路径的代谢通量

利用系统代谢工程在微生物细胞内构建一条高效合成目标化学品的代谢路径，是提高微生物细胞工厂性能的关键。在化学品的代谢合成路径中，当底物与化学品之间合成路径过长时，需要借助空间组织工程建立多酶复合结构，在空间上拉近路径酶之间的距离，减少中间代谢物的流失，增加代谢路径的效率[14]。此外，当路径酶催化活性低或者无法催化底物生成目标化学品时，需要借助蛋白质工程或酶定向进化策略，改造酶分子的空间结构，提高路径酶的催化效率，增加代谢路径的合成效率[7,15,16]。

1.1.1 空间组织工程

为了提高多酶代谢路径的催化效率，利用DNA、RNA 和蛋白质脚手架可以将代谢路径酶组装成空间组织，减少中间代谢产物的流失、减弱竞争代谢支路、降低有毒中间代谢产物的积累[图1(a)][7]。DNA脚手架借助锌指蛋白将路径酶特异性地锚定在DNA脚手架上[14]。例如，Chen等[14]将丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶与锌指蛋白融合，使其能够特异性结合到相应的DNA 脚手架上，当丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶的比例为1∶2 时，富马酸的产量增加到28.64g/L。与DNA 脚手架不同，RNA 脚手架利用RNA 适配体与代谢路径酶结合，组装成复杂的多维空间结构[17]。例如，在氢气的生产过程中，将氢化酶和丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶与RNA 适配体融合，组装的RNA 脚手架，使氢气的产量增加了4倍[17]。此外，利用蛋白质之间的相互作用也可以组成蛋白质脚手架[18]。例如，利用蛋白质脚手架将葡萄糖二酸合成路径中的关键酶肌醇-1-磷酸合成酶、肌醇单加氧酶和糖醛酸脱氢酶进行空间定位，使葡萄糖二酸的产量增加到2.5g/L[18]。

1.1.2 蛋白质工程

蛋白质工程通过对酶分子的设计与改造，提高了目标化学品代谢合成路径的效率[15]。蛋白质工程的主要研究方向是提高酶的催化活性和改变酶的底物或产物特异性[15,19]。利用定点突变技术可以实现酶分子的蛋白质工程改造，提高酶分子的催化活性。例如，通过对比谷氨酸棒杆菌与产琥珀酸曼氏杆菌的苹果酸脱氢酶催化特性以及晶体结构，将产琥珀酸曼氏杆菌的苹果酸脱氢酶第11 号氨基酸从甘氨酸突变为谷氨酰胺，使苹果酸脱氢酶的活性提高了2.9 倍，将琥珀酸产量提高到84.19g/L[15][图1(b)]。此外，利用蛋白质工程可以对酶进行理性设计，改变酶的底物特异性，扩展底物谱[19]。例如，利用计算机模拟酶与底物进行对接，设计的二醇脱氢酶实现了对非天然底物1,2,4-丁三醇的催化，使1,4-丁二醇的产量增加到209mg/L[19]。

蛋白质工程改造往往需要掌握酶的催化机理、结构与功能的关系，而结构与功能复杂的关系限制了蛋白质工程的应用。为了解决这个问题，发展了定向进化技术。定向进化是通过对路径酶进行多轮突变，在实验室模拟并加速天然酶进化过程，以期获得一个或多个预期性能改进的酶突变体[20]。例如，在异戊二烯生物合成途径中，异戊二烯合酶活性不足，无法有效地将二甲基烯丙基焦磷酸催化为异戊二烯。研究人员通过易错PCR 的定向进化技术，使异戊二烯合酶的活性提高了3.8 倍，将异戊二烯的产量提高到3.7g/L[图1(c)][20]。此外，DNA shuffling、增长截短法和交错延伸PCR 也可以用于定向进化中路径酶的多轮突变[16]。

1.2 平衡人工代谢路径的代谢通量

随着系统代谢工程的不断发展，人们发现平衡人工代谢路径中的代谢通量，提高了人工代谢路径的适配性，增加了代谢路径的合成效率。多元模块化工程[11]、体外代谢工程[21]和CRISPR系统[22]等技术是解决上述问题的重要途径。

1.2.1 多元模块化工程

图1 强化代谢通量的策略

图2 平衡代谢通量的策略

多元代谢工程的思路是将人工代谢路径分为不同的模块，再利用系统代谢工程对各个模块的强度进行精细化调控和协调不同模块的表达，提高模块与模块间的适配性，最终对整个代谢路径进行优化[14,23]。基于模块划分的方法，可以将多元模块化工程分为基于生化反应的模块化、基于代谢支路的模块化和基于酶转化速率的模块化[图2(a)]。基于中间代谢物的浓度作为生化指标，将化学品合成路径分为不同的模块，例如，研究人员将紫杉醇的代谢合成路径分为合成异戊烯焦磷酸与二甲基烯丙基焦磷酸的上游模块与合成紫杉醇的下游模块，利用不同强度的启动子和不同拷贝数的质粒对其进行组合优化，使紫杉醇的产量增加15000 倍，达到1.02g/L[24]。基于化学品合成代谢路径，将化学品合成路径分为中心代谢路径和支路代谢路径模块，例如，研究人员通过重新剪接代谢网络，将富马酸合成路径中的10 个基因分为还原模块、氧化模块和副产物模块，并利用系统代谢工程优化了上述模块，使富马酸的产量增加到33.13g/L[14]。基于代谢合成路径中酶转换数为指标，将不同酶促反应划分成不同模块，例如，研究人员将(2S)-柚皮素合成路径分为四个模块：由葡萄糖合成L-苯丙氨酸/L-酪氨酸组成的模块一、由L-苯丙氨酸合成肉桂酰辅酶A 或者由L-酪氨酸合成对香豆酰辅酶A 组成的模块二；由丙二酸合成丙二酰辅酶A的途径组成的模块三、由肉桂酰辅酶A合成生松素或者由对香豆酰辅酶A合成柚皮素组成的模块四[25]。经多轮模块优化后，生松素和柚皮素的产量分别提高至84.2mg/L和105.1mg/L[25]。

1.2.2 体外代谢工程

体外代谢工程的原理是在无细胞体系中模拟细胞内的级联反应，减少副反应的发生，增加代谢路径合成效率，同时也可以通过评估路径酶对代谢通路的贡献确定代谢瓶颈[26]。通过整合磷酸戊糖途径（Pentose）、双歧杆菌分流途径（Bifido）与糖酵解途径（Glycolysis），在体外组建了一个超过二十种酶组成的PBG 循环，可以有效地将葡萄糖转换为乙酰辅酶A，并通过引入聚羟基丁酸酯合成路径，使聚羟基丁酸酯对葡萄糖的得率达到90%[27]。此外，Gao 等[28]在体外构建了合成苹果酸的乙醛酸路径，通过研究单个路径酶对反应速率的影响，鉴定出异柠檬酸裂解酶催化的反应为限速步骤，并利用CRISPRi技术对路径酶进行理性调控，使苹果酸的产量增加到36g/L[图2(b)]。

1.2.3 CRISPR系统

依靠CRISPR-Cas9 基因编辑系统，可以实现转录激活、转录干扰和基因缺失三种基因操纵，为快速组装有益的基因修饰提供可能[22]。在该研究中，研究人员分别将失活的CRISPR 核酸酶与激活结构域融合，构建了用于转录激活的CRISPRa；与抑制结构域融合，构建了用于转录干扰的CRISPRi；并使用具有活性的CRISPR 核酸酶，构建了用于基因缺失的CRISPRd，并将三种系统组装，构建了可以同时实现转录激活、转录干扰和基因缺失的CRISPR-AID系统[图2(c)]。在酿酒酵母中利用CRISPR-AID 系统，使β-胡萝卜素的产量提高了3倍，使酿酒酵母细胞表面葡聚糖内切酶的表达水平提高2.5倍[22]。CRISPR-AID与高通量筛选相结合，将大大推动未来代谢工程发展。

2 提高人工代谢路径与底盘细胞的适配性

在构建微生物细胞工厂时，通常需要引入人工代谢路径用于目标化学品的合成，人工代谢路径与细胞内源代谢路径之间的交互作用，以及人工代谢路径造成的代谢流扰动，降低了人工代谢路径与底盘细胞的适配性。为了提高人工代谢路径与底盘细胞的适配性，研究人员开发了区间工程[29]策略，解除了人工代谢路径与底盘细胞内源代谢路径的交互作用；发展了生物传感器技术[30-31]、辅因子工程[32]、菌落工程[33]、反向代谢工程[34]、基因组规模网络模型[35]和进化工程[36]等策略，强化了人工代谢路径与底盘细胞整体代谢网络的适配性。

2.1 解除人工代谢路径与底盘细胞内源代谢路径的交互作用

区间工程可以将细胞质中的代谢路径在具膜细胞器中进行重构，不仅降低了人工代谢路径与胞内内源代谢路径的交互影响，而且缩短了底物与酶分子的空间距离提高了中间代谢物的传输效率[12,37]。具膜细胞器，例如线粒体[13]、过氧化物酶体[38,39]、叶绿体[40]、液泡[41]和内质网[42]等都已用于区间工程，提高了微生物细胞工厂的生产性能。例如，将异丁醇的代谢合成途径在酿酒酵母的线粒体中进行重构[13]，使异丁醇的产量增加了260%，而相同的代谢路径酶在细胞质中表达，使异丁醇的产量仅增加10%[图3(a)]。此外，为了平衡线粒体和细胞质中的代谢流分布，研究人员还开发了双代谢工程策略，平衡细胞质和线粒体的代谢流分布，充分改善乙酰辅酶A 供应，使异戊二烯的产量增加到2527mg/L[43]。令人遗憾的是，原核微生物不存在这些具膜细胞器[44]，限制了区间工程的应用。

图3 解除人工代谢路径与底盘细胞内源代谢路径的交互作用的策略

为了克服这些障碍，可以将代谢路径定位到周质空间来改善目标化学品的生产。周质空间是革兰氏阴性菌外膜与细胞膜之间的狭窄空间，呈胶状。越来越多的研究表明，原核生物的周质空间也可以用于扩展微生物细胞工厂的底物谱[45-46]、存储目标化学品[47-48]和降低副产物积累[49]。例如，Shin 等[46]通过在大肠杆菌的周质空间中表达蔗糖纤维糊精酶，使大肠杆菌直接利用纤维糊精作为底物合成2,3-丁二醇；Jeschek等[47]在周质空间中将链霉亲和素蛋白支架引入到有机金属催化剂中，制备了biot-Ru-SAV 人工金属酶，biot-Ru-SAV 可以在周质空间中催化碳碳双键的形成和再分配；本文作者课题组通过将苹果酸合成路径中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PCK）和苹果酸脱氢酶（MDH）在周质空间中进行重构[50]，使苹果酸的产量增加3.29倍，达到193mmol/L[图3(b)]。此外，通过调节信号肽可以调节顺反异构酶在周质空间中的表达，从而改造细胞膜上反式不饱和脂肪酸的含量，增加了大肠杆菌细胞的耐受性[51]。

2.2 强化人工代谢路径与底盘细胞整体代谢网络的适配性

2.2.1 生物传感器技术

图4 强化代谢路径与底盘微生物整体代谢网络适配性的策略

生物传感器是指能够感知物理信号（温度、光、磁）、化学信号（pH、溶氧）与生物信号（小分子代谢物）的生物学元件[52-53]。在微生物细胞工厂的生产过程中，物理信号和化学信号是重要发酵参数，可以用于激活或者抑制各种转录因子，用于调控基因表达，平衡代谢流，增加了人工代谢路径与底盘细胞整体代谢网络的适配性[图4(a)]。由于光信号可以瞬时移除，精确控制蛋白质的表达水平，光信号已经用于生物传感器的构建。研究人员利用光敏感蛋白构建一个光驱动的动态调控开关OptoExp，成功应用于异丁醇的生产，通过优化光脉冲周期，不仅改善了酿酒酵母的细胞生长，而且使异丁醇的产量提高了四倍[54]。微生物生长状态也可以作为信号，例如，响应细胞密度的群体感应开关，可以在细胞生长到一定阶段开启或者关闭靶基因的表达，从而解偶联细胞生长与产物合成，解除细胞生长与产物合成之间的代谢流竞争，从而优化整体生产效率[55]。例如，研究人员利用群体感应系统，调控莽草酸生产的关键节点莽草酸激酶Ⅰ，使工程菌可以在基本培养基上生长，将莽草酸的产量增加到105mg/L，而对照菌株不生长[55]。但是，这种群体感应控制模式对于控制靶点的稳定性不高，因此可能需要与其他动态调控方法相结合，以便达到更为有效的调控效果[56]。为了解决个难题，Doong 等[56]开发了分层动态调控技术，他们将群体感应开关与肌醇响应的动态开关相结合，即产物合成途径不仅受细胞密度控制，也受胞内肌醇含量控制，从而实现更加稳定的动态控制，并将该分层调控策略应用于葡萄糖二酸生产，使葡萄糖二酸的产量增加到1.98g/L。不过该研究仍然存在一个明显的缺陷，即肌醇感应的动态开关是路径依赖型，只适用于个别产品的生产，普适性非常有限。为了解除路径依赖，Gao等[57]通过组合生长/稳定期依赖性启动子与蛋白降解决定子，发展了非路径依赖型的动态调控系统。该动态调节调控系统通过调节酯水解酶应用于木糖酸生产，解决了双酶级联生产木糖酸中细胞死亡的问题，使木糖酸的产量达199.44g/L[57]。

2.2.2 辅因子工程

辅因子可以提供氧化还原电子载体与生物合成的碳骨架，是化学品合成和细胞生长的基础[32,58]。使微生物细胞工厂保持最大的碳通量用于目标化学品的合成而没有辅因子波动，对满足工业生产至关重要。为了维持辅因子平衡，人们开发了修饰辅因子特异性与辅因子再生[59-60]的辅因子工程策略[图4(b)]。例如，通过修饰辅因子特异性可以有效提高脂类化合物的得率[61]，该研究中，在解脂耶氏酵母中，将依赖NAD+的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，替换为依赖NADP+的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，使脂类化合物的得率提高了20%[61]。另一方面，基于辅因子再生系统可以显著强化辅因子的供给，提高人工代谢路径效率。辅因子再生可以有效增加莽草酸的生产[62]。在该案例中，研究人员将磷化铟纳米材料与酿酒酵母相结合，构建了生物杂合系统，在光照条件下使NADPH/NADP+的比例增加到87.1，为使3-脱氢莽草酸还原为莽草酸提供充足的辅因子，使莽草酸的纯度达到90%[62]。

2.2.3 基因组规模网络模型

基因组规模网络模型提供一种通过评估理想条件与实际条件之间的差异[63]，以精确确定代谢瓶颈的方法，为精细调控代谢合成路径，提高代谢合成路径与微生物细胞的适配性，改善工业化学品的生产提供了希望[图4(c)]。例如，借助大肠杆菌酶约束模型ec_i ML1515，可以预测微生物细胞的代谢状态，模拟不同环境条件与基因工程改造后的输出结果，筛选出过量合成赖氨酸的关键靶点，使赖氨酸的最终产量提高到193.6g/L[64]。此外，基因组规模网络模型还可以用来评价细胞工厂的生产性能，例如，研究人员构建了由1316 个代谢反应和1270个代谢物组成的Rhodococcus opacus PD630 的基因组代谢网络模型，通过比较实际产率与理论产率，发现三酰甘油、脂肪酸、脂肪酸乙酯和长链碳氢化合物的实际最高产率分别为理论最高产率的93.8%、80.4%、31.8%和10.3%[65]。

2.2.4 菌落工程

许多结构复杂的天然产物具有重要的药用价值，一方面由于原核微生物难以有效表达来源于真核生物可催化合成天然产物的路径酶，另一方面，改造酵母菌高效生产异戊二烯类化合物也非常困难[33]。为了合成天然产物，利用多菌种组成的微生物菌落，可以对复杂代谢网络进行分工协作[33]。例如，Zhou等[66]将紫杉醇前体的合成路径划分为两个模块，分别在酿酒酵母和大肠杆菌中构建，利用大肠杆菌和酿酒酵母构建的微生物群落，可以有效生产紫杉烷类化合物和异戊二烯类化合物[图4(d)]。Kong等[67]通过模块化代谢途径重构与模型预测相结合的方式，利用基因动态调控回路，创建了六个具有独特相互作用模式的微生物菌落，包括共栖、偏害共生、中立、合作、竞争和捕食。在此基础上，研究人员利用双菌组成的模型，设计了三菌和四菌组成的微生物群落，增加了人们对微生物群落空间动力学的了解，可以用于指导人工合成微生物菌落的发展[67]。

2.2.5 进化工程

进化工程是指微生物种群在一定选择压力条件下不断进化，获得有益突变的方法[图4(e)][68]。进化工程可以用于改善微生物细胞生长[68]，提高化学品的浓度、得率和生产强度[36]，发现未知的生物调控机制[69]。例如，在利用还原甘氨酸途径改造大肠杆菌，一碳化合物生长的过程中，发现由于还原甘氨酸途径与大肠杆菌适配性差，以及一碳化合物的生物毒性，降低了微生物细胞的生长速率与代谢速率。为了改善微生物细胞的生长，研究人员通过进化工程，实现了细胞代谢网络的微调，改善了微生物细胞的生长，使工程菌的对数期从65～80h 缩短到10h[68]。进化工程也可以提高工程菌对3-羟基丁酮的耐受性，从而提高3-羟基丁酮的产量。在该研究中，研究人员开发了一种基于分层动态调控“高保真模块”与“高突变模块”的自主进化突变系统，并结合进化工程方法，获得了高产3-羟基丁酮的耐受型突变株HS019，在30L 发酵罐中将3-羟基丁酮的产量提高到82.5g/L[36]。此外，进化工程成功解除了由于基因组减少对大肠杆菌生长的影响，并发现了新的生物调控机制[69]，在Escherichia coli MG1655 基因组中删除了110 万个碱基对，构建了基因组减少的工程菌MS56。在含有葡萄糖的基本培养基中，工程菌MS56的生长速率远小于野生型菌株。为了恢复细胞生长，将工程菌MS56在基本培养基中进行了807 代的进化，分离出与野生型菌株生长速率相当的菌株eMS57。多组学分析结果表明，进化后的菌株eMS57 重塑了转录和翻译谱。

2.2.6 反向代谢工程

反向代谢工程的核心是“表型-基因型-表型”。反向代谢工程可以直接从已有的表型为出发点，并借助各种分析方法，分析差异表型所涉及的基因型，获得关键靶点基因或代谢途径，然后将这些信息运用到新菌株的遗传改造，从而获得期望表型[34,70]。在链霉菌生产聚酮类次级代谢产物的过程中，其产物合成所需要的胞内代谢物来源一直是难以确定，而且也不了解链霉菌在稳定期如何特异性地将代谢通量转换到次级代谢产物的合成[70]。为了解析链霉菌合成聚酮类次级代谢产物的代谢机理，研究人员通过多组学的方法，揭示了胞内三酰甘油是聚酮化合物合成所需要的关键胞内代谢物，证明了调控胞内三酰甘油可以提高聚酮化合物的产量。在此基础上，研究人员设计了三酰甘油动态调控策略，有效提高了阿维菌素B1a、杰多霉素B30 和土霉素的产量[70]。此外，利用反向代谢工程也可以解析进化工程获得的理想表型，例如，研究人员通过进化工程获得耐受C8脂肪酸的进化菌株，通过比较进化菌株与亲本菌株的基因组序列，发现进化菌株有7个编码序列发生了突变，在亲本菌株中敲除OSH2（氧甾醇结合蛋白）和PDR1（调控多重耐药基因的转录因子）获得与进化菌株ZWE03 相近的C8脂肪酸耐受性[图4(e)][71]。

3 结语

通过采用自然或人工合成的代谢路径定制微生物细胞工厂，为高价值化学品的生物合成提供了一种经济可行的方案[3-7]，其中提高人工代谢合成路径之间以及人工代谢路径与底盘微生物之间的适配性，成为提高微生物细胞工厂生产性能的关键。为了提高微生物细胞工厂生产性能，研究人员提出了强化与平衡人工代谢路径的代谢通量以及解除人工代谢路径与底盘细胞内源代谢路径的交互作用，强化人工代谢路径与底盘细胞整体代谢网络的适配性。然而，由于微生物细胞代谢调控网络的复杂性以及代谢产物对微生物细胞的影响，现有的调控策略不能有效地提高微生物细胞工厂的适配性，从而影响目标化学品地合成。因此，一方面，基于微生物细胞代谢调控网络，开发高效的多重适配性调控技术，在细胞水平上重置代谢路径的适配性。另一方面，根据代谢产物对微生物细胞的影响，有针对性地提高微生物细胞对代谢产物的耐受性，从而增强微生物细胞工厂对代谢产物的适配性。