青稞坚黑穗病LAMP 快速检测技术的建立

杨 帆，胡章薇，姚 强

（青海大学农林科学院/青海省农业有害生物综合治理重点实验室/农业农村部西宁作物有害生物科学观测实验站，青海西宁810016）

青稞（Hordeum vulgare）为禾本科大麦属，是大麦的一种特殊类型，又名裸大麦，因其具有较强的耐寒性，多分布在青藏高原高海拔的农业区。种传病害是影响青稞安全生产的重要因素之一，其中由大麦坚黑粉菌（Ustilago hordei）引起的坚黑穗病为害较为严重。大麦坚黑粉菌的休眠菌丝体和冬孢子附着在种子表面，次年播种后分别以休眠菌丝体蔓延到芽鞘上，或冬孢子萌发形成侵染丝自幼苗胚芽鞘侵入为害[1]。受侵染植株田间显症前与健康植株无异，显症后再进行防治意义不大。凌立等于1940 年调查发现，大麦坚黑穗病的田间发病率一般在10%左右，最高可达60%[1]。利用内吸性种子处理杀菌剂进行播前种子处理可有效控制该病害[2]。虽然21 世纪坚黑穗病的发生率、危害程度均远不及20 世纪，但现生产上每年仍有发生，若不采取有效措施，病原菌随种子传播侵染，病害发生则会逐年加重[3]。在生产上，仅为了防控该病害就进行种子杀菌处理，具有一定的盲目性，同时造成一定的化学药剂残留和环境污染。因此，建立快速检测技术至关重要。

本研究应用的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi 等于2000年报道的一种能够特异、高效、快速地扩增靶基因的新型核酸扩增技术[4]。该技术在1 h 左右即可完成扩增，其灵敏度是普通PCR 的100 倍[4]。结果可通过电泳仪[5]、real-time PCR 仪[5]及浊度仪[6]进行检测，还可通过SYBR Green Ⅰ[7]、钙黄绿素[8]、羟基奈酚蓝[9]染色后用肉眼识别。目前，这种分子检测技术已广泛应用于真菌[10]、细菌、病毒[11]等方面。鉴于LAMP检测过程操作简单，反应时间短，结果易于判断，我们基于初步建立的黑穗病快速LAMP 检测体系，通过优化种子洗涤沉淀物总DNA 的提取方法[12]，以期建立完善的青稞坚黑粉菌快速检测技术体系，通过掌握种子的带菌程度，进行精准施策，为青稞绿色生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂与仪器

试验材料：青稞种子（北青1 号、北青2 号、北青3 号、北青6 号、北青8 号、昆仑14 号、昆仑15 号以及柴青1 号）及试验供试菌株大麦坚黑粉菌（Ustilago hordei）、裸黑粉菌（Ustilago nuda）、禾生指葡孢霉（Dactylobotrys graminicola）、麦类核腔菌（Pyrenophora graminea）、大麦网斑菌（Pyrenophora teres）、禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum），均由青海省农业有害生物综合治理重点实验室提供。

试验试剂：Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、dNTP Mixture、Loading Buffer，购自TaKaRa 公司；吐温-20，购自索莱宝公司；Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase（10 Isothermal Amplification Buffer、MgSO4、Bst DNA 聚合酶），购自美国NEB 公司；氢氧化钠，购自四川西陇科学有限公司。

主要仪器：DK-600A 电热恒温水槽，购自上海一恒科学仪器有限公司；TD5A 台式低速离心机，购自湖南赫西仪器装备有限公司；Centrifuge 5418R高速冷冻离心机，购自德国Eppendorf 公司；ABI 7500 实时荧光定量仪，购自美国Applied Biosystems公司。

1.2 试验方法

1.2.1 人工模拟种子带菌。取大麦坚黑穗菌菌缨1粒（约150 mg）混于2 mL 水中，分别取其1/10、1/100、1/1 000 菌悬液混入1.800、1.980、1.998 mL 水中；裸黑粉菌取冬孢子粉150 mg；其他对照病原菌，在室内培养基培养至满皿后，加入无菌水制备菌悬液。最后将其分别倒入50 g 种子中，加200 mL 水、吐温-20 1 mL，振荡5 min，洗涤液3 000 r/min 离心10 min，去上清后备用。

1.2.2 裂解液快速提取DNA。1）将“1.2.1”节中制备的人工模拟样品加入1 mL 浓度为3 mol/L 的NaOH溶液，65 ℃水浴30 min。取出离心管，加1 mol/L HCl中和，10 000 r/min 离心1 min，弃上清，加无菌水冲洗样品，至pH 值为7～8。2）用牙签分别挑取少量种子洗涤沉淀物，置于洁净载玻片上摩擦，并不时在显微镜下观察。待冬孢子破裂后取20 μL 裂解液于载玻片上与待测样品混合，转至离心管内，裂解液补足至50 μL，80 ℃水浴裂解15 min，短暂离心后-20 ℃保存备用。

1.2.3 RT-LAMP 检测青稞种子中大麦坚黑粉菌。以冬孢子粉添加量为1 粒、1/10 粒、1/100 粒、1/1 000粒和加有裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、麦类核腔菌、大麦网斑菌以及禾谷镰孢菌的种子洗涤沉淀样品提取的DNA 为检测样本，以ddH2O 为阴性对照，进行RT-LAMP 检测，并在检测结束加入SYBR GreenⅠ（10 000×）0.5 μL。供试引物为利用ITS（internal transcribed spacer）基因序列通过在线软件Primer ExploreV5（http:// primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）设计，详见表1。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。检测体系为25 μL，各组分含量如表2 所示。65 ℃反应1 h，每1 min 读取荧光，反应结束后加0.5 μL SYBR Green Ⅰ。根据实时荧光扩增（曲线若为“S”型则为阳性，呈1 条直线则为阴性）和SYBR Green Ⅰ显色法（显示绿色为阳性，橙色则为阴性）为判定依据。

表1 LAMP 引物

表2 RT-LAMP 与可视化LAMP 检测体系

（续表）

1.2.4 青稞坚黑穗病LAMP 可视化检测技术验证。随机抽选实验室保存的8 个不同品种的青稞种子各50 g，加200 mL 水、吐温-20 1 mL，振荡5 min，洗涤液3 000 r/min 离心10 min，提取DNA，方法同“1.2.2”节。获得种皮洗涤沉淀物的总基因组DNA后作为模板，ddH2O 为阴性对照，进行LAMP 可视化检测。检测体系中各成分含量如表2，反应前加SYBR GreenⅠ（10 000×）于PCR 管盖内，反应结束后，瞬时离心观察显色情况，若为绿色则为阳性，橙色则为阴性。

2 结果与分析

2.1 冬孢子破裂

大麦坚黑粉菌与裸黑粉菌成熟的单个黑粉菌冬孢子具有内壁和外壁，外壁厚且坚硬，严重阻碍冬孢子DNA 的提取。本研究参考并改进了一年四季提取小麦矮腥黑穗菌冬孢子的方法[9]，用3 mol/L的NaOH 溶液水浴种子洗涤沉淀物，65 ℃、30 min后取适量在洁净载玻片上来回摩擦，并不时放于显微镜下观察，如图1-B 时即可进行DNA 提取。由于大麦坚黑粉菌冬孢子为（5～9）μm×（6～7）μm，相比于直径为5～9 μm 的裸黑粉菌冬孢子体积至少大1 倍，因此用载玻片来回摩擦十多下，可使大麦坚黑粉菌冬孢子破裂，而裸黑粉菌冬孢子外壁却不受影响。

图1 破壁前（A）、后（B）的大麦坚黑粉菌冬孢子

2.2 RT-LAMP 检测青稞种子中大麦坚黑粉菌

人工模拟种子带菌样品的实时荧光扩增曲线（图2-A）和SYBR Green Ⅰ显色（图2-B）结果均显示，仅4 种不同冬孢子数量的种子洗涤沉淀样品为阳性，其他为阴性。表明所建立的青稞坚黑穗病快速检测技术能够特异性检测出青稞的大麦坚黑粉菌。

图2 人工模拟种子带菌检测

2.3 青稞坚黑穗快速检测技术验证

分别以随机选取的50 g 青稞不同品种（北青1号、北青2 号、北青3 号、北青6 号、北青8 号、昆仑14 号、昆仑15 号以及柴青1 号）种子的洗涤沉淀物总DNA 为模板，进行LAMP 可视化检测，结果如图3 所示，北青3 号和昆仑15 号为绿色（阳性），其他为橙色（阴性），表明北青3 号和昆仑15 号2 个品种中携带大麦坚黑粉菌，建立的快速检测体系可用于青稞播前检测大麦坚黑粉菌。

图3 青稞种子可视化LAMP 检测

3 讨论与结论

坚黑穗病是青稞生产中最为常见、发病较为广泛的种传病害之一。田间显症后只能通过拔出病株来降低种子带菌率，这种方式耗时耗力。种子处理杀菌剂的应用可有效防治大麦坚黑粉菌对青稞的侵染。但是带菌种子与健康种子表观没有差异，导致在实际生产中出现药物滥用的现象，给环境和粮食安全带来巨大压力。因此，建立种子播前的快速检测技术对生产具有重要的指导意义。然而，目前国内外对大麦坚黑粉菌的研究多集中于病原- 寄主互作[13]、分子变异和遗传结构分析[14]以及侵染机制等方面[15]，在快速检测方面成果甚少。20 世纪对于此病害检测方面的研究主要集中于传统检测，包括显微镜直接观察法、种皮携带物洗涤离心后显微观察法以及冷冻吸水纸法等[16]。

本研究为建立完善的青稞坚黑粉菌检测技术，基于初步建立的LAMP 检测体系，经裂解液快速提取法提取种子表皮携带物的总DNA 后，进行LAMP（环介导等温扩增技术）检测并验证。结果表明，裂解液快速提取法提取种皮洗涤沉淀物总基因组DNA，仅混有大麦坚黑粉菌的种子洗涤沉淀物实时荧光和SYBR GreenⅠ可视化LAMP 检测均为阳性，其他病原菌（大麦坚黑粉菌、裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、麦类核腔菌、大麦网斑菌、禾谷镰孢菌）2 种检测均为阴性。最后，通过对实际青稞种子进行检测，在8 个不同品种中检测出北青3 号和昆仑15 种子携带有大麦坚黑粉菌。

虽然目前仅有的大麦坚黑粉菌与裸黑粉菌分子生物学信息均不能区分两者，未能设计出特异性引物，但是本研究基于2 种黑粉菌在种子上带菌方式和冬孢子的体积大小的不同，成功建立出可特异性检测青稞种子中大麦坚黑粉菌的技术体系。所建立的检测技术可应用于生产，为防治青稞坚黑穗病提供科学的依据。