华薯和鄂薯系列马铃薯品种晚疫病抗病基因及水平抗性相关基因SNP位点检测

聂佳惠，李红军，宋威武，吴承金，宋波涛，田振东*

（1.农业农村部马铃薯生物学与生物技术重点实验室/湖北马铃薯工程技术研究中心/华中农业大学，湖北武汉430070；2.中国南方马铃薯研究中心，湖北恩施430070）

马铃薯作为世界上第三大粮食作物，在世界粮食安全中起着重要作用[1]。中国马铃薯的种植面积和总产量均居世界第一，目前，中国马铃薯鲜薯年产量达到9 000万至1亿t。然而，马铃薯生产易受到各种病虫害影响，其中，晚疫病对马铃薯产量和品质造成严重危害[2,3]。

马铃薯晚疫病发病与天气有关，雨水充沛年份往往发病严重。生育期发病后，地上部分植株受到侵染，叶片受损或坏死，光合作用受到严重影响，块茎无法膨大生长，造成较大的产量损失。发病后期孢子随雨水冲刷进入土壤导致块茎感染，在贮藏期发病造成严重损失。当前，晚疫病防治主要依靠喷洒化学农药。但频繁喷洒农药不仅对环境安全产生严峻的影响，而且加大了对病原菌的选择压，病原菌抗药性增强，导致化学药剂药效减弱甚至丧失。

选择和培育抗病品种是防治晚疫病最经济有效的方法。自从在野生种Solanum demissum中发现晚疫病抗病基因，育种家先后将一些主效R基因（R1～R11）转移到马铃薯栽培种中[3,4]，但不久之后发现大多数主效R基因并没有持久抗性特点，大多数已知R基因已被克服。水平抗性对晚疫病菌的选择压小，可延缓晚疫病菌的进化，抗性相对稳定持久[5]。Mosquera等[6]对184个四倍体马铃薯品种及材料进行了单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）分析，通过全基因组分析发现8个基因的SNP位点与晚疫病水平抗性关联，特定SNP位点对晚疫病田间抗性有贡献。

鄂西山区是马铃薯的传统种植区域，栽培面积达40.00万～40.67万hm2。由湖北恩施中国南方马铃薯研究中心和华中农业大学马铃薯团队选育的鄂薯和华薯系列品种为湖北马铃薯生产提供了系列化品种。鄂薯系列的部分品种在育成早期抗性表现突出，例如‘鄂马铃薯1号’、‘鄂马铃薯3号’和‘鄂马铃薯5号’。‘鄂马铃薯3号’田间抗性表现很好，曾经在鄂西和西南山区广泛种植，但现在抗性完全丧失。本研究根据国内品种已知抗病基因组成情况，选取了3个（R3a，R3b，R8）抗病基因分子标记，以及6个水平抗性相关基因SNP位点标记对30个品种进行了检测，以期对鄂薯和华薯系列品种晚疫病抗性遗传背景有一个系统了解，为生产中品种选择与布局提供指导。

1 材料与方法

1.1 参试材料

本研究所用鄂薯系列马铃薯品种‘鄂马铃薯1号’，‘鄂马铃薯3号’～‘鄂马铃薯16号’，共计15个，由湖北恩施中国南方马铃薯研究中心主持选育而成，以下简称“鄂薯x号”；华薯系列品种‘华薯1号’～‘华薯4号’‘华渝5号’‘华渝6号’‘华薯7号’～‘华薯13号’，共计13个，由华中农业大学马铃薯团队主持选育而成。‘华恩1号’和‘华恩2号’由双方联合选育而成。具体信息见表1。

1.2 马铃薯基因组提取

田间或温室采集马铃薯幼嫩叶片，利用改良的CTAB法[7]提取植物组织DNA，凝胶电泳检测DNA完整性。将DNA稀释至50 ng/μL，以RNA Polymerase II（RP2）基因为内参，PCR扩增检测质量，引物信息见表2。

1.3 抗病基因分子标记检测

R3a、R3b和R8抗性基因标记引物信息见表2。采用2×Taq Master MiX试剂（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），体系为2×Taq Master MiX 5μL，F-和R-Primer各0.5μL（5μM），ddH2O 3μL，模板1μL，总体系10μL。扩增反应：95℃5 min；95℃30 s，55～59℃30 s，72℃30 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。取8μL PCR产物在1.0%琼脂糖胶上10 V/cm恒压电泳。

1.4 目标区域SNP扩增与测序

根据Mosquera等[6]报道一些功能基因可能参与马铃薯田间抗性，其中一些基因内部SNP位点与水平抗性相关。选取6个与晚疫病田间抗性关联的目标基因，在包含SNP位点区域两端设计引物，用于扩增目标区域，引物序列参考丁德骏[9]，引物相关信息见表3。采用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase高保真DNA聚合酶（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），体系为：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTPs Mix 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，F-和R-Primer各2μL（5μM），模板1μL，ddH2O 18μL，总体系50μL。PCR扩增条件同1.3，退火温度见表3。凝胶电泳检测PCR是否扩增成功，后将PCR产物送昆泰锐生物技术有限责任公司测序，利用Snap gene软件分析目标区域SNP结果。

表1 供试马铃薯品种信息Table 1 Information of potato varieties tested

表2 R8、R3a和R3b引物序列Table 2 Primer sequences for detection R8,R3a and R3b genes

表3 目标SNP区域扩增引物序列Table 3 Primer sequences for amplification of target SNP region

2 结果与分析

2.1 鄂薯系列R3a，R3b和R8抗病基因分子标记检测

以鄂薯和华恩系列基因组DNA为模板，以RP2基因为内参，用表2所示R3a，R3b，R8引物分别扩增。如图1所示，内参基因引物能够扩增约820 bp片段。R3a引物可以在‘华恩2号’、‘鄂薯1号’、‘鄂薯5号’、‘鄂薯6号’、‘鄂薯8号’、‘鄂薯9号’和‘鄂薯10号’扩增出预期大小的片段。R3b引物可以在‘华恩2号’、‘鄂薯1号’、‘鄂薯5号’、‘鄂薯6号’、‘鄂薯8号’、‘鄂薯9号’、‘鄂薯10号’、‘鄂薯11号’、‘鄂薯13号’中扩增出预期大小的片段。R8引物可以在‘华恩1号’、‘华恩2号’、‘鄂薯5号’、‘鄂薯8号’、‘鄂薯9号’、‘鄂薯10号’、‘鄂薯14号’和‘鄂薯15号’扩增出预期大小的片段。

图1 鄂薯系列品种R3a，R3b和R8基因标记扩增电泳图Figure 1 Electrophoretic images of R3a,R3b and R8 marker amplification in Eshu varieties

2.2 华薯系列R3a和R3b抗病基因分子标记检测

以华薯系列基因组DNA为模板，以RP2基因为内参，用R3a和R3b引物分别扩增。如图2所示，内参基因引物能够扩增约820 bp片段。R3a引物可以在‘华渝6号’、‘华薯7号’和‘华薯9号’中扩增出预期大小的片段。R3b引物可以在‘华薯3号’、‘华渝6号’、‘华薯7号’和‘华薯9号’中扩增出预期大小的片段。R8引物在华薯系列中扩增特异性不好，因此，后续没有扩增。

2.3 鄂薯和华薯系列马铃薯品种中SNP位点检测

本研究在部分供试品种中检测了6个基因的SNP位点。从基因组DNA中用高保真Taq酶扩增目标区域片段，然后对PCR片段进行测序，利用测序结果判读软件Chromas在目标区域判读SNP位点。由于马铃薯为同源四倍体，同一位点四个SNP可能处于杂合状态。图3示意‘鄂薯10号’4个基因SNP位点判读结果，方框所示区域为4个基因中目标SNP位点。图3A代表STAOS2-SNP692位点为G和C；图3B代表HMGCR-SNP567位 点 为G和C；图3C代 表CYP71D11-SNP346位点为T，C和A；图3D代表Rpivnt1-SNP539位点为G和A。将19个品种SNP位点判读结果汇总于表4。有些位点显示单一SNP，表明该位点为纯合类型，例如‘鄂薯13号’CYP71D11-SNP346位点为T，表明该位点4个等位位点纯合（TTTT）；有的位点为2个SNP位点，例如‘鄂薯10号’HMGCR-SNP567位点为G/C，表明处于杂合状态。有的位点显示存在3个SNP位，例如‘鄂薯10号’CYP71D11-SNP346位点为T/C/A。表4灰色背景标记SNP位点为有益SNP位点，即对晚疫病抗性有贡献的位点。总体上看在扩增 品 种 中STAOS2-SNP692，HMGCR-SNP567，CYP71D11-SNP346和Rpivnt1-SNP539的有益SNP位点出现频率高，有些有益SNP位点处于纯合状态，有些处于杂合状态。PLOX1-SNP8089位点在所测品种中都处于纯合状态。

2.4 鄂薯和华薯系列马铃薯品种抗性与标记和SNP位点关系分析

主效R基因控制的抗性表现往往与晚疫病菌生理小种有关。随着田间生理小种的变化，含有R基因抗性品种的表现也会发生变化。各品种审定或登记时的抗性表现及标记结果见表5。R3a抗病基因已被克服。就R3b和R8而言，鄂薯系列中，品种抗性与抗病基因分子标记有无总体呈正相关，例如：检测到R3b分子标记的‘鄂薯1号’、‘鄂薯6号’和‘鄂薯13号’的区试抗性为中抗以上；检测到R8基因分子标记的‘鄂薯14号’、‘鄂薯15号’和‘华恩1号’区试抗性表现均为中抗；同时检测到R3b、R8基因分子标记的‘鄂薯5号’和‘华恩2号’区试表现为中抗以上。有些品种中检测到抗病基因分子标记，但区试抗性表现为感病，例如：‘鄂薯8号’～‘鄂薯11号’。另外，‘鄂薯3号’、‘鄂薯4号’和‘鄂薯16号’未检测到R3b和R8抗病基因分子标记，但区试抗性表现为中抗以上。华薯系列品种中‘华薯3号’、‘华渝6号’、‘华薯7号’和‘华薯9号’检测到R3b分子标记，但区试评价均为中感。

图2 华薯系列品种R3a和R3b基因标记扩增电泳图Figure 2 Electrophoretic images of R3a and R3b marker amplification in Huashu varieties

图3 ‘鄂薯10号’中4个基因SNPs位点检测结果Figure 3 Detection of SNPs of four genes in'Eshu 10'variety

表4 6个基因晚疫病抗性SNP位点判读结果Table 4 Interpretation results of SNPs of six late blight resistance related genes

目前认为R8基因是一个具有广谱和持久的田间抗性的基因。分析2020年恩施田间晚疫病抗性评价结果与R8基因标记的关系，鄂薯和华恩8个品种具有R8基因标记，晚疫病抗性评级覆盖3级（中抗，2/8），4级（中感，5/8）和5级（感病，1/8）。另外，无R8基因的品种抗性级别也存在变化，例如‘鄂薯4号’表现为3级中抗，‘鄂薯7号’则感病。表明R8基因标记有无与田间抗性表现存在较为复杂的关系。

如表5所示，华薯系列中STAOS2-SNP692、HMGCR-SNP567、CYP71D11-SNP346和Rpivnt1-SNP539出现频率较高，位点有杂合有纯合，但整体抗性表现较差。例如：‘华薯3号’中检测到4个纯合的SNP位点，抗性表现仍为感病；‘华薯11号’检测到2个纯合位点、3个杂合位点，抗病表现仍为感病。可见供试品种2020年恩施抗性评价级别与SNP位点关联度较低。

表5 品种抗性、分子标记与SNP位点结果汇总Table 5 Summary of resistance,molecular markers and SNPs of all the cultivars

3 讨论

聚合多个抗性基因是培育抗晚疫病品种的重要方法之一。分析已育成品种中抗病基因组成是获得优良抗病品种的重要基础。本研究利用已开发的R3a、R3b和R8分子标记，对3个系列品种进行了R基因组成分析，发现鄂薯和华恩系列品种中R基因出现频率较高。R3a抗病基因已被克服[10]；R3b抗病基因对某些病原菌小种仍具有一定的抗病性；R8抗病基因具有广谱和持久的田间抗性[11]，抗病能力较好。鄂薯和华恩的17个品种中，有9份检测出R3b分子标记，8份检测出R8分子标记，除‘鄂薯8号’、‘鄂薯9号’和‘鄂薯10号’区试抗性表现为感病外，其余品种均表现为抗病，表明该系列品种抗病能力主要由抗病基因提供。除‘华渝5号’外，华薯系列区试评价均为中感，但检测到4个品种含有R3b分子标记。这种情形可能是部分病原菌小种能克服R3b基因，或分子标记不准确造成。刘勋等[12]通过分子标记检测到‘华薯2号’和‘鄂薯3号’中含R3b抗病基因，但本研究并未检测到，表明R基因分子标记的准确性仍需提高。另外，部分品种中未检测到抗病基因分子标记，但抗性表现较好，例如：‘鄂薯4号’，推测该品种中含有其他抗性基因。

尽管R8抗病基因具有持久的田间抗性，但当前中国马铃薯产区存在“超级毒力”小种可以克服R8基因[10]。从本研究的结果来看，具有R8标记的8个鄂薯和华恩品种抗性级别田间存在差异，但是总体而言，中抗和中感占比（7/8）更高。由于2020年马铃薯生长季节恩施天气多雨潮湿，晚疫病发病很严重，绝大部分品种田间抗性表现很差，也可能导致抗性评价没有分辨度，抗性与标记之间的关系被掩盖。

水平抗性对多种晚疫病菌小种表现抗性，抗性较为稳定，微效多基因对水平抗性具有一定贡献[13]。本研究挑取了6个与水平抗性紧密关联基因的特异SNP位点，探索育成品种中的SNP位点分布，以期了解这些位点是否与水平抗性相关。根据Mosquera等[6]报道，水平抗性SNP位点对晚疫病抗性贡献与该位点剂量有关，即该位点趋向纯合时贡献更明显。本研究中，STAOS2、HMGCR、CYP71D11和Rpivnt1基因的有益SNP位点在品种中出现次数较多，频率达79%以上，各基因特异位点的纯合比例各不相同，分别为38.8%、60.0%、26.3%和57.9%。但综合华薯、鄂薯和华恩系列的品种区试抗性表现，发现相关品种的区试抗性并未提高，表明抗性表现与SNP位点分布无明显关联。然而丁德骏[9]研究结果表明一些SNP位点与其研究群体材料晚疫病抗性存在一定关联。这种差异可能受马铃薯的遗传背景、田间的实际发病情况、晚疫病菌的变化等因素影响。就多年田间种植观察，‘华恩1号’、‘华恩2号’、‘华渝5号’和‘华渝6号’具有较好田间抗性。

研究结果显示鄂薯、华恩和华薯系列部分马铃薯品种含有R3a和R3b基因，鄂薯和华恩系列含有R8基因。同时，部分马铃薯品种中检测到一些与田间抗性有关的SNP位点。抗病基因标记、田间抗性有关的SNP位点存在与否与晚疫病抗性评价结果存在复杂的关系，有待根据多年的田间抗性评价结果判断。本研究结果可为进一步深入探究标记与抗性之间的关系奠定较好基础。

2017年各地区马铃薯（折粮）播种面积和产量