基于网络药理学分析黄芩-黄连药对抗流感的作用机制

李泽明，黄传君，徐淑静，张才擎

（1.山东中医药大学 中医学院，山东 济南 250014；2.山东大学 药学院，山东 济南 250012；3.山东第一医科大学第一附属医院，山东 济南 250013）

流行性感冒（Influenza），简称为流感（flu），是一种由流感病毒引起的急性呼吸道疾病[1]。流感的主要表现为高热、头痛、乏力、咳嗽和全身肌肉酸痛，可有鼻塞、流涕、胸骨后不适等，体温可达39 ～ 40 ℃。流感病毒容易发生变异，主要通过飞沫及接触传播，传染性强。潜伏期一般为1 ～ 7 d，多为2 ～ 4 d[2]。流感病毒属于正粘病毒科，是一种负义单链RNA 病毒。流感病毒根据内部核蛋白和基质蛋白抗原属性不同,可分为4 个亚型，分别为甲型（influenza virus A）、乙型（influenza virus B）、丙型（influenza virus C）、丁型流感病毒 （influenza virus D）[3]。其中甲型和乙型流感病毒呈季节性流行，据WHO 报道，全球流感流行每年造成约300 万至500 万严重病例，其中约有29 万至65 万死亡病例[4]。目前西医治疗流感的药物主要有扎那米韦、磷酸奥司他韦、帕拉米韦和辛酸拉尼米韦。

中医药治疗流感具有悠久的历史，并显示出广阔的前景[5]。黄芩-黄连药对是临床上典型的清热解毒药对之一，前者善清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎，后者长于清中上二焦湿热。两药常相须为用，为临床常用药对[6]。基于对现代药理学的研究，网络药理学作为一种新的药物设计与开发策略被提出，它是在系统生物学的基础上，从整体的角度探讨“药物-靶点-疾病”之间的关系，因此对新药的研发具有指导意义[7]。它强调了药物可以通过多途径调节信号通路，以提高药物的疗效并降低毒副作用[8]。中医药讲究整体观、辨证论治的原则，这与网络药理学所强调的整体性、系统性相一致[9]。因此，在网络药理学方法的基础上，本研究从系统、整体水平分析黄芩-黄连药对抗流感病毒“多因、多效、多靶点”的作用机制。

1 材料与方法

1.1 黄芩、黄连化学成分收集

利 用TCMSP 数 据 库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和相关文献对黄芩、黄连的化学成分进行检索和收集。

1.2 黄芩-黄连药对作用靶点的筛选

在TCMSP 数据库中检索黄芩、黄连的靶点信息，将药物的类药性（DL）＞0.18，口服生物利用度（OB）＞30%作为筛选参数。然后利用Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org/）矫正药物的靶点名称，最 后 在Swiss Target Prediction 数 据 库（http://www.swisstargetprediction.ch/）中补充药物的靶点信息从而得到相关靶标蛋白。

1.3 流感作用靶点的获取

以“Influenza”为关键词在GeneCards 数据库（https:// www.genecards.org/）中检索以获得流感的作用靶点。

1.4 预测黄芩-黄连药对抗流感的靶点

将黄芩、黄连与流感的靶点分别录入到Venny在线软件（版本2.1，https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/ venny/）中，绘制韦恩图，进而得到黄芩-黄连药对抗流感的靶点。

1.5 “药物-成分-疾病-靶点”网络构建

运用Cytoscape 软件（版本3.7.1）对黄芩-黄连药对的有效活性成分、活性成分调控的靶点、靶点与流感的关联进行分析来构建“药物-成分-疾病-靶点”相互作用网络图。

1.6 构建蛋白相互作用（PPI）网络

以minimum required interaction score ＞0.4 为 筛选参数，用STRING 数据库（https://string-db.org/）检索上述得到的黄芩-黄连药对抗流感的潜在靶点，得到靶点相互作用的网络关系数据，然后将数据导入Cytoscape 软件中，绘制出蛋白相互作用网络图。

1.7 通路富集分析

将Bioconductor 软 件 包“org.Hs.eg.db” 安 装在R 软件（版本3.6.0）中并运行，然后将上述得到的药物-疾病共同靶点转换成entrezID。接着将“clusterProfiler”软件包安装在R 软件中，以P ＜ 0.05，Q ＜ 0.05 为参数，利用已转换的entrezID，进行关键靶基因GO（gene ontology）与KEGG（KEGG pathway analysis）功能富集分析，并将结果以条形图形式输出。

2 结果

2.1 黄芩-黄连药对的有效成分

在TCMSP 数据库中设定DL 0.18、OB 30%，结合文献[10]补充纳入黄芩苷，共得到有效成分49 个。黄芩、黄连有效成分的编号、名称和药材归属，见表1。其中黄芩中的黄芩新素（neobaicalein）、降穿心莲黄酮（panicolin）、5,7,4'-三羟基-8-甲氧基黄酮（5,7,4'-trihydroxy-8-methoxyflavanone）、黄芩黄酮II（Skullcapflavone II）、2,6,2',4'-四羟基-6'-甲氧基查尔酮（2,6,2',4'-tetrahydroxy-6'-methoxychaleone）、二氢木蝴蝶素 （dihydrooroxylin），黄连中的黄麻甙A（corchoroside A ）、穆坪马兜铃酰胺（moupinamide）、巴马汀（palmatine）、广玉兰内酯（magnograndiolide）等成分具有较高的OB 值，表明在黄芩-黄连药对抗流感的过程中，这些成分可能发挥重要作用。

2.2 黄芩-黄连药对的作用靶点

在UniProt 数据库中输入上述得到的49 个有效成分对应的靶点，然后使用Swiss Target Prediction 数据库补充相应的靶点信息，删除去重后共得到276 个药物靶点，含有黄芩186 个，黄连158 个，共同靶点68 个（见图1）。

2.3 流感的作用靶点

在GeneCards 数据库中检索关键词“Influenza”，去重后共得到疾病靶点2 503 个。

2.4 黄芩-黄连药对抗流感的靶点

将276 个药物靶点、2 503 个疾病靶点输入到Venny2.1 在线软件作图工具平台上，并绘制韦恩图，两者取交集后得到药物-疾病共同靶点123 个（见图2）。

表1 黄芩-黄连药对的有效成分Tab.1 Active components of herb pair containing Scutellariae Radix and Coptidis Rhizoma

2.5 “药物-成分-疾病-靶点”网络分析

在Cytoscape 软件中输入黄芩-黄连药对的49 个有效成分与123 个药物-疾病共同靶点，然后绘制出“药物-成分-疾病-靶点”相互作用的网络图（见图3）。图中绿色代表123 个共同靶点，蓝色代表中药黄芩-黄连药对中的36 种有效成分（13 个有效成分的靶点与疾病靶点无交集），红色代表疾病，紫色代表药物。使用Network Analyzer 对网络图进行分析发现：槲皮素（quercetin）、黄芩苷（baicalin）、汉黄芩素（wogonin）、黄芩黄素（baicalein）、β-谷甾醇 （β-sitosterol）、黄连碱（coptisine）、刺槐素（acacetin）、表小檗碱（epiberberine）等能够连接10个以上的靶点，表明这8 个成分可能在黄芩-黄连药对抗流感的过程中发挥重要作用；靶点PTGS2、PTGS1 与活性成分连接次数达30 次以上，对黄芩-黄连药对抗流感具有重要意义；靶点NOS2、PRSS1的连接次数达20 次以上，靶点ESR1、CASP3 的连接次数达9 次以上，证明它们也可能是黄芩-黄连药对抗流感过程中的有效靶点。

图1 药物靶点分布情况统计图Fig. 1 Statistical chart of drug target distribution

图2 黄芩-黄连药对治疗流感靶点韦恩图Fig. 2 Vene diagram of herb pair containing Scutellariae Radix and Coptidis Rhizoma on influenza target

图3 “药物-成分-疾病-靶点”网络图Fig. 3 “Drug-ingredient-disease-target”network diagram

2.6 蛋白相互作用（PPI）网络分析

将上述得到的123 个共同靶点输入到STRING 数据库中，经过分析得到蛋白相互作用的网络图（见图4）。每条边代表蛋白与蛋白之间的相互作用关系，线条越多表示关联度越大，得到PPI 图中的靶点排序（排名前30 见图5）。结果显示，靶点蛋白AKT1、VEGFA、IL6、TNF、CASP3、EGFR、JUN、MYC、CXCL8、MAPK1、CCL2、IL1B、PTGS2、IL10、MMP9、ICAM1、IL2、FN1、FOS、CYCS、ESR1、RELA 的Degree 值大于50（Dgree 值表示活性成分与作用靶点的关联个数，Degree 值越大表明该靶点越重要），推测这些靶点有助于黄芩-黄连药对抗流感作用的发挥。将“药物-成分-疾病-靶点”网络中的关键作用靶点映射到PPI 网络中，发现CASP3、PTGS2、ESR1 等可能是黄芩-黄连药对的有效成分发挥抗流感作用的关键靶点。

图4 靶点相互作用PPI 图Fig. 4 PPI diagram of target interaction

2.7 GO 及KEGG 通路富集分析结果

图5 PPI 图中的靶点排序（排名前30）Fig. 5 Target ranking in PPI （top 30）

经R 语言运行后，123 个共同靶点的GO 富集结果包括三部分，分别是生物学过程、细胞组分及分子功能。GO 结果表明，在生物学过程中，共富集了1 800 条交集基因集合，其中，有341 条富集基因的数目大于10个，主要包括response to oxidative stress（氧化应激反应，36 个基因）、response to toxic substance（对有毒物质的反应，35 个基因）、response to molecule of bacterial origin（对细菌来源分子的反应，34 个基因）、reactive oxygen species metabolic process（活性氧代谢过程，29 个基因）、cellular response to drug（细胞对药物的反应，27 个基因）、regulation of apoptotic signaling pathway（细胞凋亡信号通路的调控，26 个基因）等（见图6），表明黄芩-黄连药对可能在多个生物学过程的共同作用下发挥其抗流感的疗效；在细胞组分表达过程中，共富集了52 条交集基因集合，其中，有14 条富集基因数目大于10 个，主要包括membrane raft（膜筏，14 个基因）、membrane microdomain（膜微区，14 个基因）、membrane region（膜区，14 个基因）、vesicle lumen（囊腔，12 个基因）等（见图7）；在与分子功能相关的过程中，共富集了132 个交集基因集合，其中，有17 条富集基因数目大于10 个，主要包括cofactor binding（辅因子结合，19 个基因）、cytokine receptor binding（细胞因子受体结合，18 个基因）、protein heterodimerization activity（蛋白质异二聚活性，16 个基因）、endopeptidase activity（内肽酶活性，14 个基因）、receptor ligand activity（受体配体活性，14 个基因）等（见图8）。经过R语言运行后，123 个共同靶点共得到158 条KEGG 通路，KEGG 功能富集的条形图中排名前20 的结果见图9，其中，P 表示富集的显著性，颜色越红说明显著性越高。结果表明黄芩-黄连药对治疗流感的共同靶点主要涉及Influenza A（甲型流感，27 个基因）、PI3K-Akt signaling pathway （PI3K-Akt 信号通路，22个基因）、MAPK signaling pathway （MAPK 信号通路，19 个基因）、Toll-like receptor signaling pathway （Toll样受体信号通路，18 个基因）、NOD-like receptor signaling pathway （NOD样受体信号通路，17个基因）、HIF-1 signaling pathway（HIF-1 信号通路，17 个基因）、NF-kappa B signaling pathway （NF-κB 信号通路，14 个基因）等，表明黄芩-黄连药对的有效成分可能在多个信号通路的协同分工下发挥抗流感的作用。

图6 黄连-黄芩药对抗流感的GO 富集分析-生物过程Fig. 6 GO enrichment analysis of herb pair containing Scutellariae Radix and Coptidis Rhizoma against influenza-biological process

图7 黄连-黄芩药对抗流感的GO 富集分析-细胞组分Fig. 7 GO enrichment analysis of herb pair containing Scutellariae Radix and Coptidis Rhizoma against influenza-cellular component

图8 黄连-黄芩药对抗流感的GO 富集分析-分子功能Fig. 8 GO enrichment analysis of herb pair containing Scutellariae Radix and Coptidis Rhizoma against influenza-molecular function

图9 黄连-黄芩药对抗流感的KEGG 富集分析Fig. 9 KEGG enrichment analysis of herb pair containing Scutellariae Radix and Coptidis Rhizoma against influenza

3 讨论

药理学研究表明，黄芩中主要含有黄酮类、挥发油和多糖等成分，具有解热镇痛、抗病毒、抗炎、抗菌、抗氧化及抗肿瘤等药理作用[11]。生物碱类化合物是黄连的主要成分，此外，黄连中还含有木脂素类、黄酮类等成分[12]，具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用[13]。

从黄芩-黄连药对抗流感的韦恩图可知，黄芩-黄连药对中49 个活性成分作用于123 个靶点。主要活性成分包括槲皮素、黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、β-谷甾醇、黄连碱、刺槐素、表小檗碱等，目前已有文献报道了槲皮素、黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素等黄酮类化合物治疗流感的相关研究。槲皮素可以降低流感病毒感染的小鼠死亡率，抑制病毒复制, 减轻肺部炎症, 从而对流感病毒感染的小鼠有治疗保护作用[14]。黄芩苷可通过下调TLR7/MYD88 介导的信号通路来抑制甲型流感病毒感染的小鼠肺组织的病理损伤和炎症反应[15]。汉黄芩素可以抑制甲型流感病毒感染后肺泡巨噬细胞内各种炎症相关因子的产生[16]。黄芩素在体外可能通过干扰流感病毒H1N1中后期mRNA 的合成抑制病毒的复制而具有抗流感病毒活性[17]。且槲皮素属于黄连成分，黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素属于黄芩成分，这为两药配伍治疗流感提供了合理的理论基础。在细胞水平上，IL6、TNF[18]、CASP3[19]、EGFR[20]、NOS2[21]已 被 证 明 是 流感的主要靶点，提示黄芩-黄连药对可能是通过这些靶标调节细胞凋亡，减少病毒复制，抑制流感的疾病进程。此外，还有部分关联性较高的靶点在目前的研究中还没有得到明确的证实，如AKT1、ESR1、PTGS2、PTGS1、PRSS1 等，这可以作为解释黄芩-黄连药对抗流感分子作用机制的一个新方向。

GO 分析结果表明，抗流感病毒靶点的基因所涉及的生物过程不仅与抗病毒靶点的作用密切相关，而且能够参与并影响药物发挥抗病毒活性的整个药理过程。进一步分析发现疾病靶点主要发生在生物学过程环节，如氧化应激反应、对有毒物质的反应、细胞凋亡信号通路的调控等。KEGG 通路富集分析结果显示，甲型流感、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、Toll 样受体信号通路、NOD 样受体信号通路、HIF-1信号通路、NF-κB 信号通路等是黄芩-黄连药对抗流感的潜在靶点涉及的主要通路。甲型流感病毒传播迅速、传染性强且易发生变异，是流感病毒中最常见的一种类型，而黄芩-黄连药对靶基因富集通路甲型流感，说明它能够有效治疗流感。PI3K/AKT 信号通路可以通过凋亡信号调节激酶1（ASK1）负调控c-Jun 氨基末端激酶（JNK）通路抑制甲型流感病毒诱导的Bax 介导的细胞凋亡[22]。p38 MARK、JNK MARK 等通路属于MAPK 家族，它们在炎症介质的调控过程中起着重要的作用，与流感的治疗也有密切的联系[23]。TOLL 样受体和NOD 样受体为模式识别受体，与流感病毒相关的信号通路主要集中在TLR4和TLR7[24]及NLR3 亚型中[25]。HIF-1 信号通路与重症流感患者密切相关[26]。NF-κB 信号通路是流感病毒感染后激活的一个重要的细胞通路，它可以不同程度的调节病毒RNA 的合成，促进病毒的复制[27]。由此可以推测，有多条信号通路与黄芩-黄连药对抗流感的作用机制有关。

4 结论

本研究在网络药理学及相关文献研究的基础上，对黄芩-黄连药对抗流感的主要成分和潜在靶点进行了预测，最终发现49 个活性成分，123 个潜在靶点。根据通路富集分析的结果可推测黄芩-黄连药对发挥其抗流感作用的药效基础主要集中在甲型流感、PI3K-Akt 信号通路和MAPK 信号通路上。因此，本研究初步证明了黄芩-黄连药对可以在多成分、多靶点、多通路共同作用下起到抗流感的效果，但作为作用机制的理论探讨，后续还需利用动物实验进行验证。