超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定牛奶中19种喹诺酮类抗生素

马俊美，范素芳，孙 磊，张明星，张冬生，李 强

（河北省食品检验研究院 河北省食品安全重点实验室 石家庄050000）

喹诺酮类抗生素（Quinolones，QNs）又称吡酮酸类或吡啶酮酸类抗生素，是一类具有抗菌谱广，抗菌性强，价格低廉等特点的人工合成抗菌药，广泛用于人和动物疾病的预防和治疗中[1-2]，然而摄入含有QNs 残留的动物源性食品，除造成药物致敏和其它对人体的毒副作用外，还容易产生细菌耐药性[3]。联合国粮农组织、欧盟、美国食品和药物管理局等均制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量[4]。我国农业部也对动物源性食品中多种喹诺酮类药物制定了最高残留限量[5]。

目前，QNs 的检测方法主要有：酶联免疫分析法[6-7]、高效液相色谱法[8-14]、高效液相色谱-串联质谱法[15-21]。酶联免疫分析法容易出现假阳性结果，多用于筛查。高效液相色谱法仅靠保留时间进行定性，因此抗干扰能力弱。高效液相色谱-串联质谱法具有特异性强，灵敏度高等优点[22-26]，已成为动物源性食品中药物残留分析的首选方法。当前现行检测动物源性食品中喹诺酮类抗生素的国家标准方法为高效液相色谱-串联质谱法[27-28]，均采用外标法定量，GB/T 20366-2006[27]的前处理方法中需要大量提取液提取，经正己烷除脂后再旋转蒸发浓缩，耗时长；GB/T 21312-2007[28]需用缓冲盐溶液提取，再经传统HLB 固相萃取小柱净化，操作繁琐。

本试验采用PRiME HLB 新型固相萃取小柱，不需要活化、平衡、洗脱等步骤，直接将牛奶中的磷脂等非极性干扰物吸附在填料内，待测物过滤到收集瓶中，简化了操作步骤，节省了前处理时间。本文将该技术与超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（Ultra high performance liquid chromatography quadrupole electrostatic field orbital ion trap mass spectra，UPLC/Q-Orbitrap）相结合，用于牛奶中QNs 定性筛查与定量检测研究。通过一级质谱全扫描获得待测物的一级精确质量数，进行定性与定量，通过二级质谱扫描模式获得待测物的二级特征图谱并确证，提高了分析效率，保证了检测结果的准确性，适合大批量样品中喹诺酮类药物残留的快速测定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

甲醇、乙腈（色谱纯级），美国Thermo Fisher公司；甲酸（色谱纯级），美国Sigma 公司；超纯水，广州屈臣氏公司。

标准品：吡哌酸（Pipemidic acid，PIP，99.1%）、依诺沙星（Enoxacin，ENO，99.9%）、马波沙星（Marbofloxacin，MAR，99.9%）、诺氟沙星（Norfloxacin，NOR，99.1%）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL，99.0%）、氟罗沙星（Fleroxcain，FLE，99.7%）、培氟沙星（Pefloxacin，PEF，99.0%）、环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP，94.0%）、洛美沙星（Lomefloxacin，LOM，99.5%）、丹诺沙星（Danofloxacin，DAN，94.0%）、恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR，99.9%）、奥比沙星（Orbifloxacin，ORB，97.7%）、沙拉沙星（Sarafloxacin，SAR，97.0%）、司帕沙星（Sparfloxacin，SPA，99.0%）、双氟沙星（Difloxacin，DIF，96.1%）、噁喹酸（Oxolinic acid，OXO，99.8%）、西诺沙星（Cinoxacin，CIN，99.9%）、萘啶酸（Nalidixic acid，NAL，99.6%）、氟甲喹（Flumequine，FLU，99.0%）、诺氟沙星-D5（Norfloxacin-D5，NOR-D5，99.0%），德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

Ultimate 3000 超高效液相色谱仪-四极杆/静电场轨道阱（Q-Exactive）组合式高分辨质谱仪，美国Thermo Fisher 公司；氮吹仪，美国Organomation Associates.Jnc 公司；3K15 离心机，美国Sigma公司；超声波清洗仪，德国Elma 公司；旋涡振荡器，德国IKA 公司；Waters Oasis PRiME HLB 固相萃取柱（60 mg/3cc），美国Waters 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理 准确称取2.0 g 牛奶样品于50 mL 离心管中，加入20 ng 内标（诺氟沙星-D5），再加入1%甲酸乙腈7 mL，涡旋混匀1 min，定容至10 mL，9 500 r/min 离心3 min，取5 mL 上清液过PRiME HLB 固相萃取柱，收集全部流出液，40℃下氮气吹干，加入1 mL 10%甲醇水溶液，涡旋混匀。复溶液过0.22 μm 滤膜，待测定。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：Acquity BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm；美国Waters 公司）。流动相A 为0.1%甲酸水溶液，B 为乙腈。梯度洗脱程序：0～2.0 min，B 相保持10%；2～9 min，B 相从10%线性升至80%；9～12 min，B 相保持80%；12～13 min，B 相从80%线性降至10%；13～15 min，B相保持10%。

1.2.3 质谱条件 质量分析器：四极杆/静电场轨道阱；电喷雾离子源（正离子）；扫描模式：Full MS/dd-MS2；鞘气流量35 Arb；辅助气流量10 Arb；喷雾电压：3.8 kV；离子源温度350 ℃；毛细管温度320 ℃。Full MS 扫描范围：m/z 100～1 500，分辨率：70 000，AGC target 为3×106。dd-MS2分辨率17 500，AGC target 为1×105，隔离窗口为4.0 m/z，Fixed first mass 为120.0 m/z，碰撞能为30 eV。19种QNs 质谱信息见表1。

表1 19 种QNs 的质谱信息Table 1 Mass parameters for the 19 quinolones

（续表1）

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

与传统三重四极杆的MRM 采集方式不同，本研究采用高分辨质谱的Full MS/dd-MS2采集方式，可同时进行一级全扫描和数据依赖的二级质谱扫描，简化了质谱参数的优化过程，提高试验效率，更利于样品的快速筛查和定量分析。试验采用Q-Extractive 对19 种QNs 混合标准溶液进行正离子扫描，图1为19 种QNs 和诺氟沙星-D5 的提取离子色谱图（50 ng/mL），可以根据保留时间及精确质量数对目标物进行初步定性。从表1可以看出，19 种QNs 的质量数相对偏差均小于3.0×10-6，符合欧盟2002/657/EC 增加的LC/MS 目标准则，因此可以根据理论精确质量数对目标物进行确证[29-30]。图2为19 种QNs 的二级特征图谱，通过碎片离子信息，可以进一步提高定性的准确性。

2.2 提取溶剂的选择

本试验考察了不同溶剂（乙腈、0.5%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈） 对19 种QNs 的提取效果，加标浓度为20 μg/kg 时，19 种QNs 的平均回收率见图3。从图3可看出，用乙腈作为提取溶剂，回收率普遍较低，随着甲酸的加入，目标物的回收率增大，这是由于喹诺酮类抗生素的结构上有羧基和哌嗪基，具有酸碱两性，易溶于酸性或碱性溶剂。采用1%甲酸乙腈对目标化合物的提取效果最好，19 种QNs 的回收率在86.6%～100%范围内。用0.5%甲酸乙腈作为提取溶剂时，沙拉沙星的回收率为74.3%，用2%甲酸乙腈作为提取溶剂时，萘啶酸的回收率为77.3%，回收率较低。这可能是由于甲酸浓度较低时，蛋白沉淀不完全，使提取液不够澄清，过固相萃取小柱时有损失，进而影响回收率；甲酸浓度较高时，可能会影响离子化效率，使样品溶解性减弱。因此，本试验选取1%甲酸乙腈进行提取并沉淀蛋白。

图1 19 种QNs 和诺氟沙星-D5 的提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms of the 19 quinolones and norfloxacin-D5

图2 19 种QNs 的二级质谱图Fig.2 MS2 spectra of the 19 quinolones

2.3 净化方式的优化

牛奶中存在大量的磷脂，会干扰目标化合物的分析，影响色谱柱的使用寿命，增加仪器系统的维护成本和难度。图4比较了仅通过酸化乙腈提取和经酸化乙腈提取后PRiME HLB 小柱净化的空白牛奶样品的磷脂监测信息。从图中可以看出，净化后的样品本底干扰明显降低，说明PRiME HLB 能有效去除样品中的磷脂等非极性干扰物，同时提高了净化效率，大大节省了前处理时间。

2.4 方法的线性范围、检出限和定量限

在牛奶空白提取液中添加标准溶液，配制一系列的标准工作液，以19 种QNs 与内标的一级质量数提取离子峰面积的比值为纵坐标（Y），各组分的浓度为横坐标（X），做线性回归方程，采用空白基质加标的方法确定方法的检出限（Limit of detection，LOD）和定量限（Limit of quantification，LOQ），信噪比RS/N≥3 和RS/N≥10 时，对应的质量浓度分别作为LOD 和定量LOQ。由表2结果可知，19 种QNs 在0.5～200 μg/L 质量浓度范围内线性关系良好。检出限为0.1～0.5 μg/kg，定量限为0.2～1.0 μg/kg，低于GB/T 20366-2006[27]和GB/T 21312-2007[28]。

图3 不同提取溶剂对19 种喹诺酮类药物回收率的影响Fig.3 Effect of different extraction solvents on the recoveries of 19 quinolones

图4 空白牛奶样品的磷脂离子色谱图Fig.4 Chromatograms of PC product ion in milk sample

表2 19 种QNs 的线性关系、检出限、定量限Table 2 Linearity，LOD and LOQ of 19 quinolones

（续表2）

2.5 回收率和精密度

在空白牛奶样品中添加19 种QNs 标准溶液进行加标回收率试验，共添加3 个水平，每个水平重复6 次，加标回收率和精密度试验结果见表3，添加水平0.2～10.0 μg/kg 时，方法的回收率范围在62.1%～100.4%之间，相对标准偏差（Relative standard deviations，RSD）在0.13%～7.08%之间，回收率和精密度符合残留分析方法的要求。

表3 19 种QNs 的回收率和RSDTable 3 Spiked recoveries and RSDs of the 19 quinolones

2.6 实际样品检测

采用本方法，对市售20 批次牛奶样品进行检测，采用一级精确质量数和保留时间对样品中的QNs 定性筛查，并结合二级特征碎片离子确证，未检出阳性样品，与标准方法GB/T 20366-2006[27]和GB/T 21312-2007[28]的测定结果一致，然而本方法在检测效率、检测成本、灵敏度等方面优于标准方法。

3 结论

本研究建立了UPLC/Q-Orbitrap 测定牛奶中19 种QNs 的方法，并进行了方法学验证。牛奶样品经过酸化乙腈提取后，通过PRiME HLB 固相萃取柱净化，该方法提高了检测效率，降低了检测成本，为牛奶中19 种QNs 的批量检测提供技术支持，也可为其它基质中其它QNs 的快速检测提供方法参考。