苹果自然发酵酵素微生物多样性分析

康晓乐，李东霓，李 晨，2，康红艳，2，王妙姝，2，田洪涛，2，3*

（1 河北农业大学食品科技学院 河北保定071001 2 河北新希望天香乳业有限公司 河北保定071001 3 国家北方山区农业工程技术研究中心 河北保定071001）

我国苹果产量巨大，成熟苹果味道酸甜可口，营养丰富，富含多种生物活性物质，如多糖、粗纤维、蛋白质、维生素B1、维生素B2、维生素C 等多种成分，具有降胆固醇，降血压，润肠通便，促进新陈代谢等功效[1]。然而，近些年我国苹果出现严重滞销现象，不仅有损果农收益，给整个苹果产业发展也造成了很大困扰，因此，增加苹果的深加工力度，拓展苹果产品种类具有重要意义。

酵素产品因其具有加速代谢、杀菌消炎等显著的功效，而倍受国内外消费者的欢迎。研究表明，酵素相关产品富含酚类、有机酸类、酶类、黄酮类等活性物质，可以辅助清除体内废物，促进淋巴细胞生长，具有解酒护肝，消炎抗菌，润肠通便，美容抗衰等功效[2]。长期以来，食用酵素以自然发酵为主，多为混种共生发酵，发酵周期长，发酵过程中参数变化复杂。目前，学者对食用酵素的研究多集中于其代谢产物、抗氧化性能、酶活力等方面。对酵素产品发酵过程中微生物多样性分析的文献较少，而且，对于微生物多样性分析，大多数学者采用传统分离纯化鉴定方法、PCR-DGGE 技术等。如：蒋增良[3]采用传统方法从葡萄酵素中分离鉴定出3 种酵母菌。吴伟杰等[4]利用传统法分离菌株，采用分子生物学方法鉴定萝卜泡菜中的乳酸菌，共分离鉴定出12 个菌种，包括：植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸肠球菌等。杜丽平等[5]采用聚合酶链式反应变性、梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术分析木瓜酵素自然发酵过程中细菌和酵母的多样性及变化规律，结果显示：主要有植物乳杆菌、假肠膜明串珠菌、类肠膜魏斯氏菌、酿酒酵母假丝酵母、毕赤酵母等。杨芳等[6]利用PCR-DGGE技术，检测6 种自然发酵酵素的优势菌，结果显示：细菌分布于3 个属5 个种，包括：乳杆菌属、醋杆菌属；优势酵母分布于3 个属6 个种。以上结果表明，不同酵素中有相同的菌属，也有其特有的菌属，不同菌株在发酵中的作用有待深入研究。传统分离鉴定法和PCR-DGGE 技术虽然可以在一定程度上反映样本的物种组成和优势物种，但是不能全方位解析菌群组成和结构。此外，采用传统的分离培养方法，培养的微生物种类有限，仅占环境样品的1%～10%[7]，可能会遗漏一些种类的微生物，甚至是在酵素发酵过程中起关键作用的微生物，导致无法解析发酵过程中微生物的组成、丰度及其变化情况。

宏基因组（Metagenome）是指在一定环境中所有微生物的基因总和。传统培养方法不能培养出所有的微生物，而宏基因组学方法不依赖微生物培养而是直接提取样品全部微生物的遗传物质[8]，更全面的包含了环境样品的微生物遗传信息。应用第二代测序技术和生物信息学、系统生物学的数据分析方法，分析不同样品中微生物的群落组成、丰度、物种多样性，分析微生物与环境之间的影响，有利于全面认识微生物群落结构。随着分子生物学技术的发展，宏基因组学在很多行业得到广泛应用。例如：基础微生物学、海洋微生物学[9]、土壤学、医学[10]、生态农业、食品领域。

本研究以自然发酵苹果酵素为试验材料，通过对细菌16S rDNA V3-V4 区和真菌ITS1 区分析的宏基因组学技术，探明苹果酵素在自然发酵过程中微生物的多样性及其菌群动态变化规律，为进一步筛选苹果酵素自然发酵优良的优势微生物菌种，研制高效直投式发酵剂，实现人工控制发酵苹果酵素系列新产品，提高苹果酵素产品生产效率与质量，提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

新鲜成熟苹果，河北丹凤山农业科技有限公司。白砂糖（食品级），百乐超市；娃哈哈纯净水；VC（分析纯级），天津市鑫铂特化工有限公司；5 L玻璃罐。

FLC-3 超净台，哈尔滨市东联公司；YXQSG46-280S 型不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SPX-150B-Z型生化培养箱、FA1004A 电子天平、ABI GeneAmpR9700 型PCR 仪，上海博迅实业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备 用无菌水将苹果洗净，于无菌操作台中晾干，去核，去除果蒂，切片。白砂糖和蒸馏水用紫外线杀菌30 min，按质量比将白砂糖∶苹果∶水=1∶8∶10 加入到已灭菌的玻璃罐中[11]，添加0.006%的VC[12]，置于30 ℃培养箱，静置发酵40 d[13]。

1.2.2 样品采集 在超净工作台中取苹果酵素发酵第10，20，35 天的样品45 mL 加入灭菌的离心管中，-80 ℃冰箱保存，用于宏基因组研究。

1.2.3 宏基因组测序流程

1） 样品处理 分别取在-20 ℃保存的3 个时期的酵素样品，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清，取沉淀用于DNA 抽提。

2） DNA 抽提 根据E.Z.N.A.Rsoil 试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.） 说明书进行总DNA 抽提，DNA 浓度和纯度利用NanoDrop2000 检测，利用2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取质量。

3） PCR 扩增采用引物1737F（GGAAG T AAAAGTCGTAACAAGG） 和2043R（GCTGCGTT CTTCATCGATGC）对真菌ITS1 区进行扩增。采用引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）对细菌16S rDNA V3-V4 区进行扩增。

4） Illumina Miseq 测序 使用2%琼脂糖凝胶回收PCR 产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA） 进行纯化，Tris-HCl 洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）进行荧光检测定量。根据Illumina MiSeq 平台（Illumina，San Diego，USA）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2*300 的文库。

Illumina MiSeq 平台文库构建[14]：①连接“Y”字形接头；②使用磁珠筛选去除接头自连片段；③利用PCR 扩增进行文库模板的富集；④氢氧化钠变性，产生单链DNA 片段。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平台进行测序。原始数据上传至NCBI 数据库中。

Illumina MiSeq 平台测序原理[15]（此部分操作由上海美吉生物医药科技有限公司完成）：①DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；②另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥（bridge）”；③PCR 扩增，产生DNA 簇；④DNA 扩增子线性化成为单链。⑤加入改造的DNA 聚合酶和带有4 种荧光标记的dNTP，每次循环只合成1 个碱基；⑥用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上的核苷酸种类；⑦将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3' 端粘性，聚合第2 个核苷酸；⑧统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA 片段的序列。原始测序序列使用Trimmomatic 软件质控，使用FLASH 软件进行拼接。

1.2.4 生物信息分析流程 样品数据分析由上海美吉生物医药科技有限公司完成。MiSeq 测序得到的PE reads 首先根据overlap 关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后选出与OTU 代表序列相似性在97%以上的序列进行OTU 聚类分析和物种分类学分析。基于OTU 聚类分析结果，进行多种多样性指数（Chao，Ace，Shannon，Simpson）分析、Alpha 多样性分析[16]；基于分类学信息，在属分类水平上进行群落结构统计。根据以上结果分析苹果酵素自然发酵不同时期的细菌和真菌的组成、多样性、相对丰度以及动态变化。

2 结果与分析

2.1 苹果酵素自然发酵不同阶段样本PCR 扩增结果

通过离心收集菌体，提取样品中总DNA，然后对细菌16S rDNA V3-V4 区和真菌ITS1 区进行PCR 扩增，利用2%琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果见图1。

图1表明，细菌16S rDNA V3-V4 区扩增后凝胶电泳检测条带长度在500 bp 左右。真菌ITS1区扩增后凝胶电泳检测条带长度约为300 bp。说明PCR 产物目的条带大小正确，浓度合适，可进行后续试验，利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）进行检测定量。根据Illumina MiSeq 平台（Illumina，SanDiego，USA）标准操作规程，将纯化后的扩增片段构建PE 2*300 的文库。

2.2 苹果酵素自然发酵不同时期样本稀释曲线及高通量数据统计分析

对序列采用随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们对应的物种数目或多样性指数，构成稀释曲线[17]。用来比较测序数据量不同的样本中物种的多样性、均一性或丰富度，也可用来说明样本的测序数据量是否合理。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以较完整的反映样本的物种信息。结果见图2和图3。

图1 不同时期样本微生物DNA 片段PCR 扩增结果Fig.1 PCR amplification results of sample microbial DNA fragments in different periods

图2 3 个样本中细菌的测序稀释曲线Fig.2 The rarefaction curve of bacteria in 3 samples

图3 3 个样本中真菌的测序稀释曲线Fig.3 The rarefaction curve of fungi in 3 samples

图2和图3显示，在97%相似度水平上，起初曲线直线上升是由于3 个样品中分别对细菌和真菌的测序量少，不足以覆盖样品中物种数，随测序量增加，物种数急速增加；之后曲线趋于平缓，说明随测序量增大，物种数不再增加，测序量足够大，能够较完整的反映苹果酵素样本中绝大部分的微生物信息。

为保证分析结果的可靠性，既要有充足的测序数据量，也要保证序列的质量，因此，测序后要对原始数据进行过滤处理，得到优化序列。然后在去除嵌合体序列后进行OTU 聚类分析。高通量测序结果见表1和表2。

表1 细菌高通量测序数据Table 1 High-throughput sequencing data of bacteria

表2 真菌高通量测序数据Table 2 High-throughput sequencing data of fungi

表1和表2可知，通过提取样品DNA，对细菌338F-806R 区扩增得到细菌的优化序列数135 033 个，优化碱基数目59 756 429 个；对真菌1737F-2043R 区扩增，Illumina MiSeq 平台测序数据处理之后，得到真菌的优化序列数227 417 个，优化碱基数目72 649 655 个，表明本次结果可信度高。结果显示苹果酵素自然发酵3 个时期样本中包含细菌Species 数386 个，聚类分析得到466个OTU。真菌Species 数5 个，聚类分析得到8 个OTU。

2.3 苹果酵素自然发酵不同时期样本的微生物多样性分析

基于OUT 聚类分析结果，Chao 常用来估计物种总数，Ace 可估计群落中OUT 数目的指数，Shannon 和Simpson 用于估算微生物多样性，Shannon 数值越大则多样性越高，而Simpson 指数值越大则多样性越低[18]。结果见表3和表4。

表3 苹果酵素的细菌多样性指数Table 3 Bacteria diversity index of apple fermented beverage

表4 苹果酵素的真菌多样性指数Table 4 Fungal diversity index of apple fermented beverage

由表3可知，苹果酵素自然发酵不同时期样品中，细菌多样性指数Chao 和Ace 值先减小后增大，表明在整个发酵时期细菌的物种总数存在先减少再增多的变化过程。第10 天Shannon 值最大而Simpson 值最小，表明苹果酵素在发酵前期细菌多样性最高。由表4可知，3 个样品随发酵时间的延长，真菌多样性指数Chao 值和Ace 有所增大，表明在发酵过程中，真菌物种数有所增多。Shannon 值逐渐增大而Simpson 值逐渐减小，表明真菌多样性随着发酵时间的延长有所增多。细菌的Chao 值、Ace 值和Shannon 值均比真菌的高，Simpson 值比真菌低，说明细菌多样性大于真菌的多样性。

Alpha 多样性图，以Chao，Shannon，Ace，Simpson，Coverage 为度量标准，采用柱形图展现结果，可以反映一个特定区域或者生态系统内物种的多样性。不同时期样本细菌和真菌的Alpha 多样性分别见图4和图5。

图4和图5显示，苹果酵素自然发酵第10 天的样品可以检测到337 种细菌，4 种真菌；第20天的样品可以检测到79 种细菌，5 种真菌；第35天的样品可以检测到299 种细菌，5 种真菌。

本课题组在此之前对桑葚自然发酵酵素宏基因组学的研究发现，细菌物种数也存在先降低后增加的过程。田伟[19]研究的四川泡菜中也存在发酵中期微生物多样性降低的现象。本研究结果提示，自然发酵过程中可能存在优势菌的富集，抑制其它菌生长的现象。

2.4 苹果酵素发酵过程中微生物群落结构分析

使用统计学的分析方法，将多个样本的群落结构放在一起对比分析，既可以观测样本在不同分类水平上的群落结构，也可以观测其变化规律。本试验在属水平上分析苹果酵素不同时期样品微生物群落结构及动态变化，结果见图6、图7。

由图6可知，宏基因组测序技术显示，此苹果酵素样本中细菌组成在属水平上分类主要有乳杆菌属（Lactobacillus）、葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter）、乳酸乳球菌属（Lactococcus）、魏斯氏属（Weissella）、明串珠菌属（Leuconostoc）、醋酸菌属（Acetobacter），还有少量其它菌（Others）。乳杆菌属是第1 阶段丰度最大的菌属，占比为58.73%，第2，3 阶段有所下降，占比分别为49.08%，56.34%，然而仍是主要菌属。葡萄糖酸杆菌属占比先增加后降低，分别为20.42%，34.72%，24.64%。乳酸乳球菌在所测得的3 个阶段占比变化不大，3 个时期分别为6.51%，8.25%，8.12%。明串珠菌属占比分别为2.15%，1.97%，1.76%。醋酸菌属在第1，2 阶段占比极少，分别为0.97%，1.10%，第3 阶段增加到3.27%。魏斯氏菌属占比分别为1.84%，0.98%，2.18%。第1 阶段其它菌占比为9.38%，第2，3 阶段占比逐渐下降为3.90%，3.69%。本研究结果表明，苹果酵素自然发酵过程一直存在乳酸菌发酵。葡萄糖酸杆菌贯穿发酵始终，该菌含有多种酶类，可以产生多种重要化合物，这些化合物在发酵中起着重要作用，可能影响发酵过程中抗氧化性能的变化。酵素中酶活力的强弱可能与葡萄糖酸杆菌中富含酶有关。醋酸菌在后期有所增长，说明后期可能存在醋酸发酵。明串珠菌呈逐渐下降的趋势，说明其可能是前期启动发酵的菌株。魏斯氏属是异型发酵，与产品的风味形成相关。

图4 细菌Alpha 多样性分析Fig.4 The Alpha diversity analysis of bacteria

图5 真菌Alpha 多样性分析Fig.5 The Alpha diversity analysis of fungi

由图7可知，苹果酵素自然发酵样本中真菌的物种多样性比细菌少，在属水平上主要有酵母属（Saccharomyces）、汉逊酵母属（Hanseniaspora）、接合酵母属（Zygosacharomyces），还有少量未知菌占比较低。第1 阶段：接合酵母属占89.5%，汉逊酵母属占9.7%；第2 阶段：接合酵母属占18.2%，汉逊酵母属占60.6%，酵母属占19.3%；第3 阶段：接合酵母属占80.3%，汉逊酵母属占8.7%，酵母属占9.4%。本研究结果表明，接合酵母属是第1 阶段和第3 阶段的主要菌株，汉逊酵母属是第2 阶段的主要菌株。酵母菌是发酵工业中经常被利用的菌种，如啤酒和果酒的发酵[20]。有些酸马奶的发酵也采用酵母菌[21]。由此可见，酵母菌在发酵过程中起到很重要的作用。冯彦君[22]、杨培青[23]已将酵母菌应用于人工控制发酵酵素中。

图6 3 个样品在属水平上的细菌组成Fig.6 The bacterial composition of three samples at genus

本课题组在此之前对桑葚自然发酵酵素宏基因组学的研究发现，乳杆菌属占比达80%～90%，葡萄糖酸杆菌占比不足1%，研究结果与本研究有所差距。桑葚自然发酵酵素中的真菌主要为酵母属和汉逊酵母属，在种类和丰度上与本研究有所差异。可能是由于桑葚和苹果的生长环境、地区、季节不同，其表面附着微生物也有差异；制作工艺、发酵温度、物料比例不同等，造成菌的种类及丰度有所差异。2 个研究的共同之处为主要菌种相似，并且真菌多样性都比较低，远比细菌多样性少。均存在酵母属、汉逊酵母属、乳杆菌属、葡萄糖酸杆菌属、乳酸乳球菌属、魏斯氏属、明串珠菌属和醋酸菌属。

3 讨论

虽然酵素产品消费市场十分火热，在2018年12月21日中华人民共和国工业和信息化部发布了QB/T 5323-2018《植物酵素》，规定了植物酵素的产品分类、要求、试验方法、检验规则及标志、包装、运输和贮存要求，然而其发酵机理和发酵工艺尚未十分明确。因此，探索酵素在自然发酵过程中微生物的多样性及其菌群的动态变化规律，对于了解自然发酵酵素潜在质量安全问题，以及进一步分离优势菌株，开发人工可控发酵酵素，具有十分重要的理论意义和实践应用价值。

图7 3 个样品在属水平上的真菌组成Fig.7 The fungal composition of three samples at genus

酵素在自然发酵过程中，存在微生物种类多，发酵机制复杂，过程不易控制，产品品质难以保证等问题，通过宏基因组学技术可以对苹果酵素自然发酵不同时期样品进行微生物多样性分析。本研究结果表明，苹果酵素自然发酵过程中微生物种类十分丰富，其中，细菌生物多样性远远大于真菌生物多样性。通过属水平分析细菌和真菌的种类和丰度可知，乳杆菌属、葡萄糖酸杆菌属、接合酵母属和汉逊酵母属是发酵过程中的优势菌属。由此推断苹果酵素自然发酵过程存在酵母菌发酵和乳酸菌发酵，以及其它发酵途径。酵母菌能分解环境中可利用的糖产生酒精和二氧化碳，酿酒酵母可以抑制杂菌生长[24]。乳酸发酵产生乳酸、乙酸、酒精以及其它风味物质，使体系的pH 值降低，抑制了某些不耐酸菌的生长。Bergillos-meca等[25]研究植物乳杆菌C4 可以在体外调节肠道微生物群，促进一些和代谢相关的微生物种群的变化和SCFA 生产的转移，说明酵素加速代谢的作用可能与植物乳杆菌相关。葡萄糖酸杆菌属和醋酸菌属可将中间产物葡萄糖酸和酒精转化为醋酸以及其它风味成分。此外，明串珠菌属和魏斯氏属可产生乙醇、乙酸、甘露醇等物质，对酵素的风味有一定影响[24]。由于发酵过程中，不同发酵阶段微生物的种类和数量也发生变化，各种生化反应和微生物间相互作用，赋予了苹果酵素独特的风味和营养价值。

综上所述，苹果酵素自然发酵过程中存在着菌种的动态变化，菌株之间的相互作用机理及某些菌株在不同时期发挥的作用和作用机制有待探索发现。本研究通过宏基因组学技术，分析苹果酵素自然发酵过程中微生物的种类、丰度和动态变化，探明了苹果酵素自然发酵过程中的优势菌株，为进一步筛选获得苹果酵素自然发酵中的优势菌株，研制高效直投式发酵剂，实现人工控制发酵苹果酵素系列新产品，提高苹果酵素产品生产效率与质量安全水平，推动苹果深加工产业技术进步与产业发展提供了理论依据。