胆固醇处理对采后青菜低温贮藏品质和抗氧化的影响

王向阳，方勇刚，李 楠，任 焕，顾 双，程周周

（浙江工商大学食品与生物工程学院 杭州310018）

青菜是中国产量最大的蔬菜之一。采后青菜含水量高，呼吸代谢旺盛，在贮藏中容易失水萎蔫、黄化，还原型抗坏血酸（AsA）快速下降。青菜在10 ℃和20 ℃贮藏，黄化是贮藏主要限制因子，在2 ℃下萎蔫是主要问题[1]。3%O2能保持青菜较好的品质，结合1-MCP 处理，保鲜效果更佳[2]。聚丙烯薄膜包装能延长青菜的货架期[3]。46 ℃热水处理的青菜经低温贮藏，其货架期较对照组延长了5 d，热处理可以延缓叶绿素降解[4]。1-MCP 处理显著延长了西兰花的货架期，而青菜的货架期仅延长了10%～20%[5]。6-BA 处理可以减缓青菜的黄化、失重、呼吸强度，减少丙二醛（MDA）含量的上升，维持较高的总酚含量及DPPH 清除能力[6]。蔗糖浸泡青菜，显著抑制了青菜的黄化[7]。

采后蔬菜品质下降与自由基有关。果蔬组织有一套完整的活性氧清除系统[8]。主要有过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和超氧化物歧化酶（SOD）等。外源胆固醇处理能提高高粱幼苗抗冷的能力[9]，提高膜保护酶的活性，保护叶绿体，增加细胞在低温下膜的稳定性和流动性[10]。豆甾醇能保持芦笋的绿色，提高SOD、CAT 等活力，降低MDA 积累，延缓芦笋货架寿命[11]。胆固醇能阻止芦笋叶绿素降解，抑制木质化[12]，在体外溶液中能阻止叶绿素降解，在体内抑制不饱和脂肪酸降解，延缓叶绿素结合蛋白分解，从而阻止叶绿素降解[13]。

心血管疾病常被认为与血清胆固醇含量过高有关，而加拿大、韩国等国未把胆固醇作为膳食限量的成分[14-15]。2015年初发布的《美国居民膳食指南》取消了每日膳食胆固醇摄入的限量[16]。我国2016 版《中国居民膳食指南》也没有胆固醇摄入限制。青菜是幼嫩叶菜，采后使用1-MCP 等抑制成熟的保鲜剂来阻止变色和AsA 下降效果有限。

本文采用胆固醇处理青菜，探讨胆固醇处理对采后青菜品质和体内抗氧化代谢的影响。保鲜剂的消耗一般为蔬菜质量的5%，保鲜后蔬菜胆固醇增量少，成本低。本研究旨在为今后使用富含胆固醇食物（例如：蛋黄中胆固醇含量为1 510 mg/100 g）处理采后蔬菜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要原料、试剂和仪器

青菜品种为“上海青”，来源于杭州郊区。每组处理20 张青菜叶片。

试剂：胆固醇、2，6-二氯酚靛酚、亚硝酸钠，阿拉丁试剂有限公司；考马斯亮蓝G250，国药集团化学试剂有限公司；还原型抗坏血酸，广东光华科技股份有限公司；试剂盒，南京建成生物工程研究所。

主要仪器：2-16KL 高速冷冻离心机，美国SIGMA 公司；UV-2550 紫外分光光度计，日本SHIMADZU 公司。

1.2 处理方法

先用少量无水乙醇将胆固醇初步溶解（保证保鲜剂溶液中乙醇含量低于0.5%），再用去离子水定容，配制成0.0125，0.025，0.05，0.1，0.2，0.4，0.5 mmol/L 的胆固醇溶液，并用1 mol/L NaOH 调节pH 值至7.0，同时配制体积分数0.6%的乙醇水溶液作为对照组。将青菜叶片去梗，沿中脉劈两半，分别作为处理组和对照组，浸泡于胆固醇和对照组溶液中，浸泡2 h 后晾干，装在开口聚乙烯袋中于2 ℃避光贮藏。经感官评价，选取0.1 mmol/L浓度处理青菜。处理后贮藏于相对湿度（RH）95%，2 ℃的冷库。分别测定贮藏0，7，14，21，28，35 d 青菜的失重率、可溶性固形物含量、叶绿素含量、丙二醛含量、可溶性蛋白质含量、还原型抗坏血酸含量、亚硝酸钠含量及酶活性（APX、SOD、GR、CAT 和POD）。间隔取样测定，重复测定3 次。

1.3 测定方法

1.3.1 失重率测定 采用称量法。

失重率（%）=（贮藏前质量-测定时质量）/贮藏前质量×100

1.3.2 可溶性固形物含量测定 取1.00 g 样品，研磨后离心（4 000 r/min，10 min），取上清液，用阿贝折光仪测定。

1.3.3 叶绿素含量测定 采用Mampholo 等[3]方法。取0.20 g 样品，加入20 mL 95%甲醇，于暗处常温提取2 h，于4 ℃下9 558×g 离心10 min。取上清液测定OD646nm和OD662nm。

1.3.4 丙二醛含量测定 采用硫代巴比妥酸法。取1.00 g 样品，加5.0 mL 100 g/L 三氯乙酸（TCA）溶液，研磨后于4 ℃下10 000×g 离心20 min，收集上清液。取2.0 mL 上清液（空白管用100 g/L TCA溶液代替），加入2.0 mL 0.67%TBA，混合后沸水浴20 min，冷却后按上述条件离心。取上清液测定OD450nm、OD532nm和OD600nm。

1.3.5 可溶性蛋白质含量测定 牛血清蛋白系列浓度，加入5.0 mL 考马斯亮蓝G250 溶液。静置2 min，测定OD595nm。标准曲线：Y=0.0056X+0.0128，R2=0.99976，式中，Y——OD 值；X——牛血清蛋白（μg）。样品测定：取1.00 g 样品，加入5 mL 蒸馏水，研磨后，4 ℃下12 000×g 离心20 min，取0.1 mL 上清液，稀释至1.0 mL，添加上述考马斯亮蓝溶液比色。

1.3.6 还原型抗坏血酸含量测定 采用Ghasemnezhad 等[17]的方法测定。配制系列浓度AsA，建立标准曲线。取1.00 g 样品加入少量20 g/L 草酸溶液，冰浴下研磨，用20 g/L 草酸溶液定容到100 mL。取10.0 mL，用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定。

1.3.7 亚硝酸钠含量的测定 采用国标GB 5009.3-2016[18]测定。系列亚硝酸钠溶液加入2 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，静置5 min，加入1 mL 2 g/L 盐酸萘乙二胺溶液，加水定容至50 mL，静置15 min。测定OD538nm，标准曲线：Y=0.0091X-0.004，R2=0.9995。式中，Y——OD 值，X——亚硝酸钠（μg）。样品测定：取5.00 g 样品，加入50 mL 蒸馏水，打浆40 s，50 mL 蒸馏水洗涤，加入少量活性炭，加热15 min 脱色、过滤。按照国标法反应，测定OD538nm。

1.3.8 酶的提取和测定 取1.0 g 叶片，加5 mL提取液（pH 7.8，50 mmol/L PBS 缓冲液）冰浴研磨至匀浆状，4 ℃下12 000×g，离心30 min，取上清液用于酶活性测定。参考试剂盒方法，所有酶采用试剂盒法测定。

1.4 数据处理

利用Excel 2010 统计试验数据，采用Excel 2010 和Origin 8.0 绘图。显著性分析采用t 检验。胆固醇处理引起青菜品质和生理指标变化之间的相关性分析：各种指标变化率（%）=（处理组-对照组）/对照组，用Excel 2010 进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 胆固醇处理对采后青菜品质的影响

人类饮食中超过90%的AsA 由水果和蔬菜提供[19]。由图1可知，采后青菜AsA 迅速减少，采用胆固醇处理可显著减少AsA 下降（P＜0.05）。可溶性蛋白质既是营养和品质指标，也是生理生化指标，其中含有多种参与生理生化代谢的酶[20]。青菜采后的可溶性蛋白质含量持续大幅下降，胆固醇处理组的可溶性蛋白质显著高于对照组。采后青菜容易失水，胆固醇处理显著降低了失水率，这可能与其脂溶性阻隔水分有关。人体摄入的硝酸盐有80%～95%来自蔬菜，一些新鲜蔬菜中硝酸盐的含量高达数千mg/kg FW[21]。蔬菜中硝酸盐在贮藏和加工中因微生物、亚硝酸还原酶可能转化为亚硝酸盐[22]。我国国家标准规定腌渍蔬菜中亚硝酸盐（NaNO2计）限量标准为≤20 mg/kg[23]。所检测的青菜的亚硝酸钠含量均低于国家标准限量。青菜冷藏14～21 d 会出现亚硝酸高峰，亚硝酸含量为0.45～0.52 mg/kg FW。胆固醇处理可推迟亚硝酸高峰1 周左右，也可降低亚硝酸含量。采后青菜的叶绿素含量迅速下降，胆固醇处理减少了叶绿素含量的下降。可溶性固形物在贮藏前期降幅很大，胆固醇处理显著抑制其下降。

图1 胆固醇处理对青菜品质指标的影响Fig.1 Effect of cholesterol treatment on quality index of pak choy

2.2 胆固醇处理对采后青菜抗氧化酶和MDA 含量的影响

APX 是以抗坏血酸为电子供体的一种过氧化物酶。APX 能催化抗坏血酸与H2O2发生氧化还原反应，H2O2被分解清除。青菜采后APX 酶活性轻微下降。由图2可知，胆固醇处理青菜的APX 酶活性在整个贮藏过程中显著高于对照（P＜0.05）。SOD 能将O2-快速歧化为过氧化氢和分子氧，胆固醇处理阻止了前7 d SOD 活性下降，而标准误差很大，影响了结果的可信度。GR 存在于植物的细胞质、线粒体、叶绿体等结构中，在叶绿体中，GR酶活性占总抗氧化酶活性的50%～80%[24-25]。GR 可将氧化型谷胱甘肽还原成还原型谷胱甘肽，并与SOD、APX 相互作用，共同清除植物体内多余的活性氧（ROS）[26]。青菜的GR 酶活性在整个冷藏过程中变化幅度较少，胆固醇处理的青菜GR 酶活性显著高于对照（P＜0.05）。胆固醇处理也提高了青菜的CAT 酶活性。胆固醇处理减少了青菜MDA的含量，MDA 的减少，可能与胆固醇维持抗氧化酶较高活性有关。

2.3 胆固醇处理效果的相关性分析

胆固醇处理能很好的维持青菜的AsA，大幅度减少青菜失重，阻止亚硝酸盐的产生。其中失重率和AsA 标准误较小，说明胆固醇处理始终有促进作用。亚硝酸盐标准误的差异很大，主要是胆固醇推迟其产生高峰时间所致。胆固醇对维持叶绿素、可溶性蛋白质、可溶性固形物含量也有较好的作用。胆固醇对SOD、APX 酶有强烈的促进作用，对GR、CAT 酶作用次之，对POD 几乎无作用。从标准误差来看，胆固醇在贮藏过程始终促进APX、GR 酶活性，前期对SOD 酶活性的促进作用较强。

图2 胆固醇对青菜丙二醛含量和抗氧化酶活性的影响Fig.2 Effect of cholesterol on MDA content and antioxidant enzymes activity of pak choy

表1 胆固醇对青菜品质和抗氧化作用指标的影响Table 1 Effect of cholesterol on quality and antioxidation indicators in pak choy

APX 主要功能是清除叶绿体中的H2O2，抗坏血酸-谷胱甘肽循环主要依赖APX[27]。0.1 mmol/L胆固醇处理青菜后，AsA 的变化与APX 的变化相关系数最高（r=0.96；P＜0.01），其次为GR（r=0.45），其提供的还原型谷胱甘肽（GSH） 有助于保持AsA。SOD、CAT、POD 与AsA 相关性较低。胆固醇同时加强APX 活性和AsA 含量。APX 是消耗AsA的酶，胆固醇处理可能加强膜的区隔化，阻止APX氧化AsA。失水率、可溶性蛋白质、MDA、SSC 与AsA 的相关系数分别为-0.88（P＜0.05），0.80（P＜0.05），-0.75（P＜0.05），0.51。失水率、可溶性蛋白质与AsA 无明显因果关系。MDA 是膜脂肪酸过氧化产物，AsA 是抗氧化剂，其下降会导致MDA 上升。SSC 含量下降，细胞会缺少能量，AsA 比例会下降。

GR 利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸），即NAD（P）将氧化型谷胱甘肽（GS-SG）催化成还原型谷胱甘肽（GSH），GSH 可以使氧化型抗坏血酸得到还原。胆固醇处理后GR 的变化与叶绿素的变化相关系数最高（r=0.90；P＜0.05），说明GSH 对于维持叶绿素含量较重要。

胆固醇处理后GR、CAT、SOD 的变化与亚硝酸盐的变化有较高的负相关。采后青菜蛋白质大量降解，氨基酸脱氨，导致氨氮上升。亚硝酸盐是氨氮转化为硝酸盐的中间物质。该3 种抗氧化酶使细胞内维持较好的还原状态，从而减少氨氮转化为亚硝酸盐。

胆固醇显著提高芦笋总抗氧化能力，抑制MDA 含量[28]。胆固醇处理后MDA 的变化与可溶性蛋白质、SSC 的变化有较高的负相关，r 值均为-0.84（P＜0.05），然而与这2 种物质没有因果关系。胆固醇处理后MDA 的变化与APX、GR、POD的r 值分别为-0.55，-0.50，-0.48。说明提高该3种抗氧化酶活力，会减少膜脂肪的过氧化。SOD 和CAT 有很高的正相关（r=0.88，P＜0.05），可能胆固醇处理导致两者同时加强。

表2 胆固醇处理对采后青菜各种指标影响的相关性分析Table 2 The correlation analysis between the changes of indexes of pak choy caused by cholesterol treatment

3 结论

0.1 mmol/L 胆固醇处理能很好地阻止青菜在冷藏过程还原型抗坏血酸含量下降，减少失重率，阻止亚硝酸盐含量上升。另外在青菜冷藏过程中，胆固醇处理可以阻止可溶性蛋白质、叶绿素、可溶性固形物含量下降。胆固醇对采后青菜SOD 和APX 酶活力促进作用最为显著，对GR 和CAT 酶也有较好的促进活力作用，而不影响POD 酶。胆固醇能稳定地促进青菜中APX、GR 酶活性。胆固醇处理后，AsA 与APX，叶绿素与GR 呈高度正相关。