二重环介导等温扩增法快速检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌

徐文文，梁玉林，王云霞，刘秀*，尹建军，周广军，宋全厚，丁梦璇，周鹏飞

1(中国食品发酵工业研究院有限公司，北京，100015)2(内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特，010110)3(山东稻香村食品工业有限公司，山东 菏泽，274100)

乳制品在食品行业中占据不可忽视的地位。据中国奶业质量报告数据显示，2011—2016年，我国每年以87.1万t的增长趋势，完成全国乳制品消耗量从2 480.5到3 204.7万t的飞越[1]；2018—2019年乳制品行业趋于稳定，但全国每年总消耗量也均为2 400万t以上，巨大的消耗在推动乳业经济发展的同时，对乳制品质量安全提出考验。根据国家食品安全标准，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌被列为乳粉中重点关注的食源性致病菌[2-3]。沙门氏菌属肠道细菌科，其通过多种毒力因子作用于人体引起肠道炎、败血症，在我国已报道的细菌性食物中毒事件中沙门氏菌占比70%以上[4]，在全球沙门氏菌也稳居前列。金黄色葡萄球菌是世界范围内另一大食源性致病菌，主要通过肠毒素污染食物引起食物中毒，2000年，日本雪印乳品公司的牛奶中毒事件就是由金黄色葡萄球菌感染造成，先后涉及8个县，14 780人中毒[5]。沙门氏菌和金黄色葡萄球菌引起的乳品污染危害不容小觑。

目前沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测多采用传统培养法或聚合酶链式反应(polymerase chain reaction， PCR)方法[6-7]。前者通过菌落形态特征及其生理生化特性进行菌种鉴定，工作繁琐且耗时较长，检测结果往往滞后于生产，无法及时为企业提供风险预警；后者虽有效提高了检测效率，但对实验人员和仪器精密度要求高，难以在车间得到有效开展。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种依托核酸进行目标物体识别的一种新技术，该技术通过4条或6条引物，在等温条件下进行核酸扩增。与其他方法相比，LAMP技术极大减少了对仪器精密度的要求，检测耗时短且灵敏度高，被广泛应用于各类微生物检测[8-13]。但现有的LAMP方法大多只能针对一种菌种进行检测，当样品中同时存在多种微生物时只能分批进行定性检测，工作量较大。本研究分别利用沙门氏菌invA侵袭蛋白A基因[14-16]和金黄色葡萄球菌nuc耐热核酸酶基因[17-18]设计合成引物，优化引物浓度并对扩增产物进行熔解曲线分析，建立二重LAMP检测体系，旨在为乳制品尤其是乳粉中的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的筛查鉴定提供一种快速、有效的检测手段。

1 材料与方法

1.1 菌株

实验共涉及15株菌株，包括3株沙门氏菌、3株金黄色葡萄球菌及另外9株非目标常见食源性致病菌，具体菌株信息见表1。

表1 菌株信息

1.2 仪器与设备

G49194G微量移液器、5804R、5424型离心机，德国Eppendorf公司；SX-700高压灭菌锅，日本Tomy Digital Biology公司；CPA323S精密天平，德国Sartorius公司；VORTEX-5涡旋仪，Kylin-bell公司；AC2-4S1生物安全柜，新加坡Esco公司；Biodrop超微量核酸蛋白分析仪，英国柏点公司；Genie Ⅱ温扩增荧光检测仪，英国OptiGene Limited公司。

1.3 试剂

脑心浸液肉汤(brain heart infusion broth, BHI)，平板计数琼脂(plate count agar, PCA)，北京路桥技术股份有限公司；细菌DNA提取试剂盒、无菌双蒸水，天根生化科技有限公司；Isothermal Master Mix(IMM)，英国OptiGene Limited公司；LAMP扩增引物，英潍捷基(上海)贸易有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 菌种培养及DNA模板制备

将表1中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等15株细菌分别接种于10 mL脑心浸液肉汤中，36 ℃、180 r/min摇床培养12小时，离心收集菌体。以灭菌生理盐水对所得菌体进行重悬，充分混匀制成菌悬液，并按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤提取基因组DNA，-20 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 引物设计与合成

以沙门氏菌invA基因，金黄色葡萄球菌nuc基因作为引物设计靶基因，利用引物设计软件Primer Explorer(primerexplorer.jb/lampv5e/index.html)进行LAMP引物设计。具体引物信息如表2，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

表2 沙门氏菌和金黄色葡萄球菌LAMP引物序列

1.4.3 单重LAMP体系的建立与二重LAMP体系的优化

12.5 μL沙门氏菌和金黄色葡萄球菌单重LAMP反应体系包括7.5 μL IMM、3.5 μL引物(2.5 pmol F3和B3，20 pmol FIP和BIP，10 pmol LF和LB)及1.5 μL核酸模板，扩增温度为65 ℃，扩增时间为30 min。

为了保证沙门氏菌和金黄色葡萄球菌扩增效率一致，对影响较大的引物浓度进行优化。分别在各自原混合引物浓度(5.2 μmol/L)的基础上，调整每种引物混合液所占二重引物混合液的体积份额改变引物浓度，引物浓度比设定为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4。

1.4.4 特异性实验验证

应用6株目标菌株和9株其他常见食源性致病菌菌株核酸，在Genie Ⅱ等温扩增荧光检测仪上分别测试单重、二重LAMP反应体系，并以荧光积累扩增曲线观察扩增结果，验证检测方法特异性。

1.4.5 熔解曲线的分析

分别以单一沙门氏菌和金黄色葡萄球菌核酸为模板，进行LAMP扩增检测并对所得产物的熔解曲线进行分析，确定沙门氏菌和金黄色葡萄球菌扩增产物的熔解曲线特征峰。同时，观察混合菌株核酸同时检测时，扩增产物熔解曲线的退火温度与单一菌株扩增熔解曲线的退火温度是否一致。

1.4.6 单一菌株检测灵敏度

以沙门氏菌和金黄色葡萄球菌核酸为模板，进行10倍梯度稀释，使核酸终质量浓度为100fg/μL～100ng/μL。采用LAMP方法分别对2种食源性致病菌各浓度核酸进行检测，每个梯度重复10次实验，把10次全部检出的最低梯度定为最低检测灵敏度。实验以无菌双蒸水作为阴性对照。

1.4.7 混合菌间扩增干扰测试

固定沙门氏菌核酸质量浓度为100 pg/μL，金黄色葡萄球菌核酸分别与之按照1∶1、1∶50、1∶100、1∶150浓度比混合形成混合核酸模板；再将金黄色葡萄球菌核酸质量浓度固定为100 pg/μL，沙门氏菌核酸分别与之按照1∶1、1∶50、1∶100、1∶150混合形成混合核酸模板，分别进行10次二重LAMP扩增检测，并对产生的熔解曲线进行分析，以此测试混合菌浓度未知情况下，高浓度核酸对低浓度核酸扩增干扰程度。

1.4.8 脱脂乳粉样品检测及与国标法的比较

将沙门氏菌、金黄色葡萄球菌分别接种于营养培养基中，36 ℃培养12 h后，以脱脂乳粉作为基质制备人工污染样品，每个样品制作10份，其中3份作为阴性对照，7份加入100CFU/mL的待检测菌液(实际菌量通过培养法进行计数获得)作为污染样品。为保证检测结果的准确性，实验前经国标方法验证所用脱脂乳粉中不含任何病原菌。

将每份样品分别采用2种方法进行检测，其中国家标准GB 4789.4—2016、GB 4789.10—2016作为LAMP方法的基准；LAMP法按照国标法进行预增菌后，取1 mL进行DNA提取和扩增检测，探讨该方法的实用性及可靠性。

2 结果与分析

2.1 二重LAMP体系引物浓度配比

不同浓度配比的二重LAMP体系对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的扩增检测结果如图1所示。由结果可知沙门氏菌∶金黄色葡萄球菌引物浓度比为 3∶1时，同浓度核酸扩增效率相对一致，均可在7.5 min产生荧光扩增曲线，因此确定沙门氏菌∶金黄色葡萄球菌最佳引物浓度比为3∶1。

a-沙门氏菌∶金黄色葡萄球菌1∶1;b-沙门氏菌∶金黄色葡萄球菌2∶1;c-沙门氏菌∶金黄色葡萄球菌3∶1;d-沙门氏菌∶金黄色葡萄球菌4∶1

2.2 特异性验证

对设计的引物进行特异性验证，结果如表3所示。单重LAMP体系及二重LAMP体系均只特异性扩增沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，而对其他非目标菌株无扩增，表明建立的方法对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA具有良好特异性。

2.3 LAMP扩增熔解曲线分析

对单重沙门氏菌、金黄色葡萄球菌扩增熔解曲线进行分析，结果如图2所示。单一沙门氏菌的熔解曲线在85～90 ℃出现，特征峰在88 ℃产生；单一金黄色葡萄球菌的熔解曲线在80～84 ℃出现，特征峰在83 ℃产生。对等浓度混合基因组核酸进行扩增，结果扩增产物分别在85～90 ℃和80～84 ℃各有一个熔解曲线特征峰，与单重熔解曲线特征峰退火温度范围一致，表明建立的二重LAMP扩增方法可实现沙门氏菌和金黄色葡萄球菌同时检测。此外，根据不同特征峰退火温度，也可直接判断菌株信息，完成菌株定性区分鉴定。

2.4 单一菌检测灵敏度

分别对不同浓度梯度沙门氏菌和金黄色葡萄球菌核酸进行LAMP法检测，结果如图3所示。阴性对照及核酸质量浓度为100fg/μL时，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌样品均无扩增曲线，≥101fg/μL时有扩增曲线。对产生扩增曲线的核酸浓度进行10次重复实验，把10次全部检出的最低梯度定为最低检测灵敏度。结果表明，当核酸质量浓度为101fg/μL时，10次LAMP重复试验有2、3次未检出；核酸质量浓度≥102fg/μL时，10次重复试验全部检出，因此规定本实验建立的二重LAMP检测方法对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌最低稳定检测灵敏度为102fg/μL。

表3 LAMP特异性荧光曲线扩增结果

2.5 混合菌间扩增干扰测试

对不同浓度配比的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌混合基因组核酸进行扩增，结果如图4。当沙门氏菌与金黄色葡萄球菌核酸浓度比为1∶1时，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌在85～90 ℃和80～84 ℃均有明显的熔解曲线，随着沙门氏菌核酸体积比减少，沙门氏菌特征峰荧光值渐渐降低，当浓度比为1∶150时，85～90 ℃已不能观察到对应沙门氏菌的熔解曲线，反之亦然。证明进行混合菌检测时，2种菌液核酸浓度比不能超过100倍，一旦超过100倍时，高浓度核酸熔解曲线会掩盖低浓度核酸熔解曲线的出现，影响目标菌株的定性鉴定。

a-沙门氏菌熔解曲线;b-金黄色葡萄球菌熔解曲线;c-混合菌熔解曲线

a-沙门氏菌检测灵敏度;b-金黄色葡萄球菌检测灵敏度

a-沙门氏菌∶金黄色葡萄球菌熔解曲线;b-金黄色葡萄球菌∶沙门氏菌熔解曲线

2.6 脱脂乳粉样品检测及与国标法的比较

制备30个脱脂乳粉样品，预增菌培养后分别进行LAMP法检测和国标法检测。结果如表4所示，100CFU/mL浓度的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌污染样品，经36 ℃增菌12 h，LAMP检出结果和国标法检出结果完全一致，未出现假阳性和假阴性结果，说明该方法具有良好的稳定性和准确性。此外，从预增菌到获得检测结果，全过程可在1 d内完成，大大缩短了国标法检测周期，更省时便捷。

表4 脱脂乳粉样品检测结果

3 讨论与结论

沙门氏菌和金黄色葡萄球菌已成为全球关注的食源性致病菌，每年感染人数达千万人，死亡病例达上万例，是我国乳粉出厂必检项目[19-21]。通常被沙门氏菌和金黄色葡萄球菌污染的乳粉外观和气味没有明显异常，消费者难以通过感官品评判断产品污染，一旦被群众食用，将对消费者和厂家造成严重的健康危害和经济损失，因此对这2种食源性致病菌的实时检测非常必要[22-23]。实验依据前人研究成果，选择沙门氏菌特有侵袭蛋白invA基因和金黄色葡萄球菌特有耐热核酸酶nuc基因进行引物设计。同时，由于不同引物本身对核酸扩增效率不同，为避免低效率扩增菌种漏检风险，保证实际检测结果准确性，对二重引物配比进行调整。结果，沙门氏菌∶金黄色葡萄球菌引物浓度比为3∶1时，建立的二重检测方法效率最佳。对6株目标菌株和9株非目标菌株分别进行单独和混合检测，对应的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌核酸均能得到特异性扩增，而其他非目标菌的菌液核酸均未产生扩增，证明引物扩增具有良好的特异性和稳定性。

现阶段应用LAMP方法对微生物的定性检测多集中在单一菌种的检测，主要原因在于LAMP引物数量多，单个目标菌的检测已达到4条或者6条引物，多重引物更会翻倍增加，引物间碱基互补配对的不确定性为LAMP多重体系的构建带来了难度。TANNE等[24]和XIA[25]等也对多重体系进行了研究，但多数仅能用于菌种快速筛查，而不能对几种菌进行同时定性鉴定。本实验采用熔解曲线法对二重LAMP扩增产物进行分析，通过观察熔解曲线、特征峰的退火温度，直接对检测菌种进行区分判定，直观简单，保证了2种菌种同时快速筛查和定性鉴定需求。

在单一菌种灵敏度检测实验中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌灵敏度均达到102fg/μL，与文献报道PCR法比较，检测灵敏度提高了10～100倍[26]，检测结果较理想。对混合菌间扩增干扰测试中设置了1∶1、1∶50、1∶100、1∶150四个浓度梯度，拟验证实际样品菌浓度不定情况下的检出限制。结果发现，当沙门氏菌和金黄色葡萄球菌浓度比相差100倍以上时，低浓度菌种核酸会被高浓度菌种核酸掩盖，使其无法产生对应熔解曲线，低浓度目标菌株产生假阴性结果，也是实验存在的一个局限，但乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测本身就是一种低浓度污染样品检测，因此实际应用中，结果局限性实现可能不大。

综上所述，本实验以沙门氏菌侵袭蛋白invA基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因设计建立的二重环介导等温扩增方法特异性强、灵敏度高，实施性好，为乳粉企业沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的风险评估提供方向，应用前景广阔。